DETEKCE SEKUNDÁRNÍCH MUTACÍ ZODPOVĚDNÝCH ZA REZISTENCI K CÍLENÉ TERAPII U PACIENTŮ S GIST METODOU SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE

Úvod:

Gastrointestinální stromální tumory (GIST) jsou mezenchymální nádory gastrointestinálního traktu. Patogeneze je spojována nejčastěji s aktivačními mutacemi protoonkogenů KIT nebo PDGFRA kódujících receptorové tyrozinkinázy. Jejich aktivitu blokuje nízkomolekulární inhibitor tyrozinkináz (TKI) imatinib mesylát (Glivec), který je využíván k cílené léčbě pokročilých a metastazujících GIST. U pacientů s primární odpovědí na terapii imatinibem může dojít ke vzniku rezistence v důsledku sekundární mutace v genu KIT nebo PDGFRA.

Metody a výsledky:

Na našem pracovišti vyšetřujeme od roku 2012 mutační stav genů KIT (exony 9, 11, 13, 17) a PDGFRA (exony 10, 12, 14, 18) z DNA izolované ze vzorků nádorové tkáně z parafinových bločků přímou sekvenací PCR produktů Sangerovou metodou. Sekundární mutaci jsme detekovali u 5/57 (9 %) pacientů. Od 01/2016 analyzujeme mutační stav KIT a PDGFRA metodou sekvenování nové generace (NGS) na platformě MiSeq (Illumina) pomocí diagnostického kitu EliGene GIST NGS (Elisabeth Pharmacon). Metoda je založena na amplikonovém sekvenování. Pro přípravu sekvenační knihovny jsou ve dvou multiplex PCR reakcích amplifikovány exony 9, 11, 13, 14, 15, 16, 17 genu KIT a exony 8, 10, 12, 14, 18 genu PDGFRA. Následně jsou k PCR produktům ligovány sekvenační adaptory nesoucí MID sekvence. Purifikované knihovny jsou kvantifikovány pomocí real-time PCR za využití KAPA Library Quantification Kitu (KAPA Biosystems), ředěny a poolovány dle zastoupení nádorových buněk ve vzorcích. Vlastní sekvenace fragmentů o průměrné délce 311 bp (KIT) a 300 bp (PDGFRA) probíhá na přístroji MiSeq. Výsledky jsou hodnoceny pomocí softwarů NextGENe (Softgenetics) a IGV (Integrative Genomics Viewer, Illumina). V příspěvku uvádíme záchyt sekundární mutace Y823D v exonu 17 genu KIT u dvou pacientů s metastazujícím GIST (po 82 a 84 měsících léčby imatinibem), vyšetřovaných metodou NGS za přítomnosti primárních aktivačních mutací v exonu 11 genu KIT.

Závěr:

Pokroky v cílené terapii TK inhibitory v souvislosti s poznáním aktivačních mutací uvedených kináz u GIST vedly k významnému zlepšení onkologické péče o tyto pacienty. Odpověď na léčbu souvisí s molekulárním subtypem nádoru. Metoda NGS nám v rámci diferenciálně dia­gnostického i prediktivního vyšetřování umožňuje precizně analyzovat množství cílových sekvencí rychleji, levněji a s vyšší citlivostí.