Detekce okultních nádorových buněk v kostní dřeni pacientek s časným karcinomem prsu

Úvod
Nejčastější příčinou recidivy karcinomu prsu je časná hematogenní diseminace. Mikrometastatická ložiska mohou být založena již v době diagnózy, kdy nejsou zjistitelné rutinním stagingovým vyšetřením. Příčinou vzniku vzdálených metastáz může být rozsev okultních nádorových buněk krevní cirkulací. Přítomnost okultních nádorových buněk v kostní dřeni koreluje s kratší dobou do recidivy a horším přežitím. K jejich detekci byly zkoumány imunocytochemické metody, pomocí kterých je možné identifikovat jednu nádorovou buňku mezi 10 000 až 100 000 buněk kostní dřeně. Použitím metodiky PCR se senzitivita zvýší na 1: 10⁶až 10⁷. Z markerů minimální reziduální choroby byly nejčastěji zkoumány různé cytokeratiny, což jsou cytoskeletální proteiny přítomné v epiteliálních tkáních. Jejich výhodou je vysoká senzitivita, bohužel ale doprovázená nižší specificitou. Proto je pro zpřesnění metodik detekce okultních nádorových buněk zapotřebí nových, pro onemocnění specifických, markerů. Jedním z nich je Mammaglobin A, produkt genu ze skupiny uteroglobinů, jehož přesná funkce není známá, ale je vysoce specifický pro tkáň prsu. Popsán je ještě vysoce homologní, ale pro prs málo specifický Mammaglobin B. V naší pilotní studii jsme hodnotili pomocí nested RT PCR expresi Mammaglobinu A a Mammaglobinu B v aspirátech kostní dřeně pacientek s časnými stádii karcinomu prsu. Z cytokeratinů jsme doplnili vyšetření na Cytokeratin 19.

Metodika
Cestou sternální punkce nebo punkce lopaty kosti kyčelní byl odebrán aspirát kostní dřeně. Vstupní kritéria obsahovala následující podmínky: primární karcinom prsu klinického stádia I, II nebo III; adekvátní radikální chirurgický výkon nebo plánovaná neoadjuvantní chemoterapie. Celkem bylo zařazeno 42 pacientek. Šestnáct (38%) s klinickým stádiem I, 9 (22%) se stádiem IIA, 16 (38%) se stádiem IIB a 1 (2%) se stádiem IIIB. Podrobná charakteristika souboru je v tabulce. Všechny pacientky byly adjuvantně léčeny ve shodě s konsensem ze St. Gallen z roku 2001. Pacientky byly adekvátně sledovány stran možné recidivy nebo úmrtí. Studie byla provedena ve shodě s Helsinskou deklarací a byla schválena místní etickou komisí. Všechny pacientky podepsaly informovaný souhlas.
Abychom se vyvarovali epiteliální kontaminace s možným zkreslením, provedli jsem incizi epidermis před zavedením punkční jehly. V druhém mezižebří jsme punkcí hrudní kosti nebo punkcí spina iliaca posterior superior lopaty kosti kyčelní odebrali 0,5 až 4ml aspirátu kostní dřeně. Z vzorků byla ihned provedena izolace mRNA pomocí komerčně dostupného kitu (QIAamp RNA Blood Kit, Qiagen, Valencia, USA) na základě postupu doporučeného výrobcem. Množství a čistota RNA byla kvantifikována na UV spektrofotometru. Dále byla připravena komplementární DNA (cDNA). Následně byla provedena dvoustupňová nested PCR amplifikace. Integrita všech vzorků RNA byla kontrolována pomocí amplifikace β-globinové mRNA. Produkty PCR byly vizualizovány pomocí elektroforézy na 1,5% agaróze. Použité priméry pro amplifikaci byly vyrobeny na základě sekvencí z NCBI databáze.

Výsledky
Transkripty mRNA Mammaglobinu A byly zjištěny ve vzorcích od 4 (9,5%) pacientek klinického stádia II (dvakrát IIA a dvakrát IIB). Tři z nich měly prokázané postižení axilárních lymfatických uzlin nádorem. Častý byl výskyt lobulárního karcinomu, který byl diagnostikován u dvou pacientek s prokázanými transkripty mRNA Mammaglobinu A. Ve skupině bez přítomnosti Mammaglobinu A byl lobulární karcinom zjištěn pouze u dvou pacientek. V žádném vzorku jsme nezjistily transkripty mRNA Mammaglobinu B. Naopak Cytokeratin 19 byl prokázán opakovaně ve všech zkoumaných aspirátech. Medián doby sledování činil 21 měsíců (7 až 30). Doposud se recidiva objevila pouze u 3 pacientek (7%), u jedné s Mammaglobinem A v kostní dřeni. V době analýzy jsme zaznamenali 2 (5%) úmrtí, která neměla vztah k nádoru (dopravní nehoda, plicní embolie).

Závěr

Na základě výsledků pilotní studie lze doporučit Mammaglobin A jako marker pro výzkum detekce minimální reziduální choroby u karcinomu prsu. Na základě tohoto markeru byly okultní nádorové buňky prokázány u 9,5% (4 ze 42) pacientek. Mammaglobin B nebyl zjištěn v žádném z vzorků. Cytokeratin 19 byl zjištěn ve všech vzorcích, a proto se zdá být nevhodným pro detekci okultních nádorových buněk. Vzhledem k technice odběru je možnost kontaminace epitelovými buňkami málo pravděpodobná. Na základě podrobné rešerše odborné literatury jsme identifikovali několik publikací s podobnými výsledky při použití Cytokeratinu 19. Naopak v jiných studiích se tento marker jevil jako poměrně vhodný. Vysvětlení může být ve variabilitě použitých technik, primérů apod. Tato diskuse nicméně přesahuje možnosti tohoto sdělení.Ve srovnání s jinými studiemi je podíl pacientek s přítomností okultních nádorových buněk relativně menší, což koreluje s malým počtem recidiv v souboru. Na vyhodnocení prognostického významu detekce Mammaglobinu A je příliš brzy. Praktický dopad studie je dvojí. Za prvé, je možné využít vyšetření k monitoraci pacientek s časnými stádii karcinomu prsu . Za druhé, metodiku lze dále zkoumat pro využití k hodnocení efektu adjuvantní léčby, který nemůžeme měřit pomocí biochemických nebo zobrazovacích metod. Hlavní nevýhodou RT-PCR je finanční a technická náročnost.

Tabulka: Soubor pacientek (n=42) a výsledky