Detekce mutací genu K-RAS metodou high resolution Melting Curve Analysis: Vzájemné srovnání metod a přístrojů souboru 153 pacientů

V současné době se již mnoha pacientům s nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC), skvamocelulárním karcinomem hlavy a krku (HNSCC) a metastazujícím kolorektálním karcinomem (CrC) dostává možnosti být léčen moderní tzv. biologickou léčbou založenou na podání preparátů, které ať již extracelulárně nebo intracelulárně inhibují funkci Egfr1 (Erbitux, Tarceva). Avšak léčebná odpověď typu kompletní či parciální remise je zaznamenána jen u relativně malého počtu pacientů (přibližně 10 %). Jednou z příčin rezistence na léčbu u přibližně 10 % pacientů je aktivující mutace kodonu 12 nebo 13 genu k-ras, který je členem MAPK signální dráhy a za fyziologických podmínek je aktivovaný receptorovými tyrosinkinázami, např. EGFR1. Tato aktivující mutace je tedy silným negativním prediktivním znakem při úvaze o léčbě inhibitory EGFR1. Cílem naší studie bylo zjistit možnosti detekce mutace genu K-ras u 153 pacientů metodou High Resolution Melting Curve Analysis (HRM) a výsledky porovnat s údaji získanými sekvenováním a pyrosekvenováním. Na statut genu k-ras jsme vyšetřili metodou HRM a paralelně odsekvenovali DNA získanou ze vzorků tumorů od 106 pacientů s NSCLC, 24 pacientů s kolorektálním karcinomem a 23 pacientek s HER2+ karcinomem prsu. Všech 153 vzorků jsme vyšetřili na třech v současnosti komerčně dostupných přístrojích umožňujících HRM analýzu – LightScanner (Idaho Technologies), Rotor Gene 6000 (Corbett Research) a Light Cycler 480 (Roche), sekvenace byla provedena klasickou Sangerovou kapilární metodou na přístroji Beckmann Coulter CEQ 8800. Vybraný soubor 20 vzorků (10 pozitivních vs. 10 negativních) tumorů plic byl navíc vyšetřen metodou pyrosekvenování PyroMark (Biotage). Data získaná pyrosekvenováním umožňují stanovit procento mutované DNA genu k-ras ve vzorku. V pozitivních vzorcích se toto procento pohybovalo v rozmezí 7-60%. Klasickým sekvenováním byla odhalena sledovaná mutace k-ras pouze ve vzorcích s procentem mutované DNA nad 30%. Metodou HRM bylo však dosaženo stejné senzitivity jako při pyrosekvenování, kdy bylo dosaženo 7% podílu mutované DNA ve vzorku. Všechny při pyrosekvenování negativní (wild type) vzorky, byly negativní při sekvenování i HRM analýze. Nebyly zjištěny žádné rozdíly v citlivosti všech tří použitých HRM analyzátorů. Ve vyšetřovaných souborech jsme sekvenováním odhalili mutaci kodonu 12 v 16 případech a kodonu 13 ve 3 případech, celkem tedy v 19 případech, což činí 12,4% pacientů. Metodou HRM jsme zjistili mutaci genu k-ras 23 u pacientů s NSCLC, 9 pacientů s kolorektálním karcinomem a 3 pacientek s HER2+ karcinomem, celkem tedy ve 35 případech, což činí 22,9% pacientů. Až na jeden vzorek bylo všech 19 sekvenačně pozitivních vzorků zároveň pozitivních metodou HRM analýzy. Citlivost všech testovaných přístrojů je srovnatelná a dosahuje citlivosti pyrosekvenování, avšak za mnohonásobně nižší cenu. Využití metody HRM vidíme v prescreeningu vzorků před následnou sekvenací, která je nyní považována za „zlatý standard“ v určování mutačního statutu genů. Aktivující mutace genu k-ras způsobuje neúčinnost inhibitorů Egfr1 v léčbě maligních onemocnění, proto by měl být před podáním těchto léčiv vyšetře mutační statut genu k-ras v buňkách tumoru.

Práce na tomto projektu je podporována granty MSM6198959216, IGA MZCR NR/7804-5 a MPO 1H-PK/45.