Detekce mikrosatelitní instability u pacientů s kolorektálním karcinomem.

Mikrosatelitní nestabilita (MSI) je způsobena selháním DNA opravných mechanismů (MMR), které za normálních podmínek opravují chyby vzniklé při replikaci DNA. Inaktivace některých genů MMR, např. hMLH1, hMSH2, hMSH6 a hPMS2 vyústí v MSI. Původně byla MSI popsána v souvislosti se zárodečnou mutací MMR genů v rodinách s hereditárním nepolypozním karcinomem kolorekta (HNPCC, Lynchův syndrom), avšak u sporadických karcinomů kolorekta je MSI nejčastěji způsobena hypermetylací promotoru hMLH1 a vyskytuje se často i u jiných karcinomů. MSI se vyskytuje asi u 10-15% všech kolorektálních karcinomů a jelikož ovlivňuje prognózu onemocnění je analýza MSI důležitým nástrojem v klinickém výzkumu a molekulární diagnostice nádorových onemocnění. Pacienti s kolorektálním karcinomem s vysokou mírou MSI mají lepší prognózu v porovnání s pacienty s mikrosatelitně stabilním (MSS) tumorem (Thibodeau, Science 2003) a to i přes skutečnost, že MSI tumory jsou rezistentní na režimy obsahující 5-FU (Ribic, NEJM 2003).
MSI je definována jako změna délky mikrosatelitů, která je způsobena insercí nebo delecí repetitivních sekvencí v tumoru v porovnání s délkou mikrosatelitů ve zdravé tkání u téhož jedince. V lidském genomu existují stovky tisíc mikrosateltiních lokusů, pro vyšetření MSI se od roku 1998 používá referenční „Bethesda panel“ 5 mikrosatelitů (Boland, Can Res, 1998). Vyšetřili jsme vzorky tumorů a kostních dření získaných od 180 pacientů operovaných v letech 2004-2006 na I. chirurgické klinice FN a LF UP Olomouc pro kolorektální karcinom. Ze vzorků tumorů a kostní dřeně byla pomocí DNease kit (Qiagen) izolována DNA, jejíž koncentrace byla stanovena přístrojem Nanodrop ND 1000.
K amplifikaci mikrosatelitů byly využity dvě duplexní PCR (jedna pro vyšetření lokusů BAT25 a D2S123; druhá pro APC a MFd15) a jedna singel PCR pro vyšetření lokusu BAT26.
Samotná analýza MSI byla provedena label-free elektroforézou na přístroji Agilent 2100 Bioanalyzer kitem Agilent DNA 1000. Následně byly vyhodnoceny vysledné elektroforeogramy PCR produktů pěti specifických mikrosatelitů z tumoru a kostní dřeně téhož pacienta. Při nestabilitě ve více než jednom lokusu byl nález hodnocen jako vysoká MSI (MSI-H), při nestabilitě v jednom lokusu jako nízká MSI (MSI-L) a při stabilitě ve všech lokusech jako MSS.
Předběžné výsledky potvrzují relativně nenáročné stanovení MSI metodou lab-on-chip elektroforézy na přístroji Agilent 2100 Bioanalyzer. V přednášce budou prezentovány výsledky analýz MSI u více než 150 pacientů s kolorektálním karcinomem, korelace výsledků s klinicko-patologickými charakteristikami onemocnění a s parametry přežití.

Analýza MSI u pacientů s karcinomem kolorekta poskytuje ošetřujícím onkologům v současné době tři typy informací. Za prvé identifikuje pacienty, kteří nemají benefit z chemoterapie založené na 5-FU. Za druhé identifikuje pacienty s celkově delším přežitím. A za třetí zaměří pozornost lékaře na případný hereditární charakter onemocnění se všemi konsekvencemi v rodině pacienta.

Práce na tomto projektu je podporována granty MSM6198959216, IGA MZCR NR/7804-5 a MPO 1H-PK/45.