Detekce herpetických virů u imunokompromitovaných pacientů metodou „real-time“ PCR

Virové infekce jsou závažnou komplikací léčby imunokompromitovaných pacientů. Naše pracoviště se zabývá především detekcí herpetických virů – Lidský herpetický virus 6 (HHV 6), Cytomegalovirus (CMV), Herpes simplex virus 1 (HSV1), Herpes simplex virus 2 (HSV2) a lidských polyomavirů – BKV, JCV. Virovou DNA detekujeme v leukocytech periferní krve, případně i v jiných materiálech (bronchoalveolární laváž, mozkomíšní mok). Průkaz provádíme metodou polymerázové řetězové reakce, která vzhledem k vysoké citlivosti a specifičnosti umožň uje zachytit reaktivaci viru již v časném stádiu. K
detekci jednotlivých patogenů máme vypracované kvalitativní metody, které jasně stanoví pozitivitu nebo negativitu vzorku. Pro kvantifikaci a monitorování dynamiky hladiny viru v průběhu terapie zavádíme kvantitativní „real-time“ PCR metodu, kterou v současné době detekujeme hladiny HHV 6 a CMV.
„Real-time“ PCR umožň uje stanovení množství specifické DNA v odebraném materiálu. Principem metody je detekce signálu (fluorescence) produkovaného během amplifikace PCR produktu. Bylo vyvinuto několik fluorescenčních systémů schopných hodnotit množství amplifikovaného produktu v průběhu celé PCR reakce. My pro diagnostiku virů využíváme systém TaqMan, založený na 5’ exonukleázové reakci Taq polymerázy. Základem je konstrukce specifické oligonukleotidové sondy s fluorescenčním značením na 5’ a 3’ konci, která je při amplifikaci specifické sekvence Taq polymerázou rozštěpena a excitovaná fluorescence je softwarově vyhodnocena. Množství pozitivního templátu v neznámém vzorku stanovíme srovnáním nárůstu fluorescence amplifikovaných standardních DNA o známém počtu kopií virového genomu. Hladinu viru vyjadřujeme počtem kopií/µg DNA.
Pro zahájení antivirové léčby HHV 6 u hematoonkologických pacientů jsou podstatné dvě za sebou jdoucí pozitivity a manifestace viru. U HHV 6 byla stanovena hladina pozitivity 100 a více kopií/µg DNA. Tato hladina byla zvolena na základě srovnání závislost počtu kopií a klinických symptomů provedeném na našem pracovišti. Citlivost metody je do 10 kopií/reakci.
Preemptivní terapie CMV infekce je zahájena po dvou následujících pozitivitách v 7 denním intervalu na základě publikovaných poznatků. Citlivost metody je také do 10 kopií/reakci.
Naším cílem je postupné nahrazování kvalitativních metod kvantitativními i u dalších patogenů, u kterých je podstatné hodnotit léčebnou odpověď sledováním hladiny viru.