Detekce aberantní DNA metylace genů AR a ZNF185 z tkání (FFPE) v různých vývojových stádiích karcinomu prostaty metodou Nested Methyl-Specific PCR (N-MSP).

   Růst karcinomů prostaty (CaP) závisí na androgenní stimulaci zprostředkované androgenovým receptorem (AR). AR patří k jaderným hormonálním receptorům aktivovaných jak na ligandu závislým, tak nezávislým způsobem. Vývoj a progrese CaP jsou stejně jako jiné nádory řízeny souhrou genetických a epigenetických změn. Nejvýznamnější epigenetickou změnou karcinomu prostaty je metylace DNA, jejímž důsledkem je umlčování genové transkripce. Je známo, že hypermetylace CpG ostrůvků v promotoru AR souvisí s pokročilými stádii CaP. Metylace promotoru AR byla detekována u metastazujících buněčných linií M12 a DU145, zatímco tumorigenní, ale nemetastazující, stejně tak benigní buňky vykazují nemetylovaný promotor AR.

   Hypermetylace DNA v promotorových oblastech tumor supresorových genů je velmi častý mechanismus genové inaktivace. ZNF185 je jedním z nových tumor supresorových genů, který by mohl hrát roli při vzniku a vývoji CaP. Exprese tohoto genu je výrazně snížena u mnoha ohraničených nádorů prostaty a vyskytuje se zejména u metastazujících typů. Protein ZNF185 asociuje s četnými strukturami regulovanými aktinem a má významnou růstově inhibiční aktivitu. Snížení exprese genu ZNF185 může být důsledkem metylace DNA, protože po ovlivnění prostatických nádorových linií (LNCaP, PC3) demetylačním agens (5-Aza2´-deoxycytidin) dochází k obnovení exprese mRNA. Souvislost mezi metylovaným genem ZNF185 a progresí CaP nebo mezi metylovanými geny ZNF185 a AR nebyla dosud studována.

   Pro metylační analýzu jsme použili kvalitativní metodu N-MSP (Nested Methyl-Specific PCR). Pro Nested PCR byly navrženy primery univerzálně amplifikující DNA po bisulfitové modifikaci nezávisle na metylačním stavu. Byly preamplifikovány krátké, přibližně 150 bp úseky ležící v blízkosti promotorů genů AR a ZNF185. Pro následné MSP byly použity dva páry primerů již rozlišující mezi metylovanou a nemetylovanou DNA. Primery pro MSP analýzu nasedaly do oblasti genu uvnitř preamplifikovaného úseku. Metoda N-MSP zvyšuje citlivost detekce vzorků DNA s problémovou amplifikací (DNA izolována z FFPE tkání). Analyzovaná DNA byla původem z normální (N), benigní (BPH – benigní hyperplazie prostaty), neoplastické (PIN – prostatická intraepiteliální neoplazie) a nádorové (CaP) tkáně od pacientů s diagnózou karcinom prostaty.