Cytometrické vyšetření u neuroblastomu – příspěvek pro diagnózu a detekci minimální zbytkové choroby

Minimální zbytkovou chorobu (dále MRD, z angl. Minimal Residual Disease) lze definovat jako přítomnost nádorových buněk v organizmu v množství nedetekovatelném konvenčními postupy. Její studium se stává v posledních letech stále aktuálnějším vzhledem k rozvoji nových diagnostických a léčebných možností. MRD vyšetřujeme před zahájením protinádorové léčby (staging), v jejím průběhu (sledování odpovědi na léčbu) a po jejím ukončení (časná známka relapsu). Pátráme po ni v kompartmentech, které jsou dobře dostupné vyšetření a nádory do nich často metastazují (kostní dřeň /KD/, mozkomíšní mok /MMM/, hraniční tkáň, lymfatické uzliny). Před autologní transplantací vyšetřujeme štěpy krvetvorných buněk. Nejčastěji se MRD vyšetřuje v KD. Cytologickým vyšetřením KD prokážeme 2-5 % nádorových buněk.
K diagnostice MRD využíváme rozdílu mezi buňkou normální a nádorovou. Pátráme po něm v době záchytu onemocnění. Pokud vstupní vyšetření není možné, je pozdější pátrání po MDR často neúspěšné. Dostatek materiálu nám umožní zvolit obsáhlou paletu vyšetření. Široké spektrum imunologických, cytogenetických a molekulárně biologických vyšetření nádoru, i když nepřinese nic nového ke stanovení diagnózy nebo odhadu prognózy, může nalézt znak nebo jejich kombinaci k průkazu MRD. MRD se prokazuje řadou způsobů. Nejvíce využívané jsou metody molekulární biologie (PCR, RT-PCR, QR-PCR a FISH), imunocytochemické a průtoková cytometrie.
Zřídka najdeme jeden antigen, který je pro nádorovou buňku specifický – většinou se jedná o specifickou kombinaci nespecifických antigenů. Hlavní výhodou průtokové cytometrie jsou rychlostí, množství vyšetřených buněk a hodnocení několika antigenů najednou. (Eckschlager T., 1999) Pro detekci MRD u neuroblastomu /NBL/ je využ ívána trojkombinace CD45-/CD81+/CD56+, případně CD45-/CD9+/CD56+. (Nagai J., 2000; Komada Y., 1998) My jsme na základě literárních údajů a vlastních testů s buněčnými liniemi zvolili kombinaci antigenů CD45-/CD81+/CD56+. (Tsang K.S., 2003; Nagai J., 2000).
Ve vzorcích primárních nádorů jsme ověřovali, zda je tento imunofenotyp stabilní. Vyšetřili jsme 36 vzorků – všechny byly pozitivní (4,4-87 % buněk mělo sledovaný imunofenotyp, průměr byl 42,65 %). Nenalezli jsme rozdíl v expresi trojkombinace mezi jednotlivými klinickými stadii. Protože všechny vzorky NBL byly pozitivní, je možné pro detekci MRD v KD u pacientů s NBL trojkombinaci CD45-/CD81+/CD56+ využít. Měli jsme také možnost vyšetřit 19 vzorků nádorů po chemoterapii. Celkově byly hodnoty výskytu pozitivity v rozmezí 0 – 70 %, průměrná hodnota byla snížena asi na polovinu (23,1 %). Tři z nich byly negativní (0-0,18 %), což je možné vysvětlit nekrózou nádoru.
Vyšetřili jsme také 6 vzorků krve u pacientů s NBL 4. KS – všechny byly negativní. Celkem jsme vyšetřili 226 vzorků KD od 50 pacientů s NBL. Za pozitivní jsme označili vzorky s více než 0,5 % pozitivních buněk, jako suspektní ty, které obsahovaly 0,21-0,49 % pozitivních buněk – 40 vzorků bylo pozitivních a 10 suspektních. Pozitivní nálezy ve shodě s literárními údaji tvořily 22 % z celkového počtu vyšetření. (Nagai J., 2000) Většina pozitivních nálezů byla od pacientů 4. KS (vyšetřeno 156 vzorků od 25 pacientů). Pozitivních bylo 39 vzorků a suspektních 10 (celkově tvořily 31,4 % všech vzorků). Jeden pozitivní vzorek (0,71 %) byl od pacienta 2. KS a jeden suspektní (0,31 %) u pacienta 3. KS. Oba byly morfologicky negativní.
Pro potvrzení MRD jsme porovnali morfologické nálezy s výsledky vyšetření cytometrem. Pouze u 2 vzorků byly zastiženy nádorové buňky morfologicky tam, kde bylo vyšetření průtokovým cytometrem negativní. Výsledky všech dalších vyšetření, která neprokázala přítomnost nádorových buně k v KD byly shodné. Průtokovým cytometrem jsme prokázali nádorové buňky u 40 vzorků, 8 z nich mělo morfologický nález negativní. Výsledek cytometrického vyšetření 11 vzorků byl označen jako suspektní a u 8 z nich bylo morfologické vyšetření negativní. Porovnali jsme výsledky vyšetření 65 dvojic vzorků KD odebraných jednomu pacientovi současně ze dvou různých míst. Do studie jsme zahrnuli pouze vzorky pacientů 4. KS, kde je největší pravděpodobnost postižení KD. Shodný výsledek jsme získali u 89,3 % pacientů (58 dvojic). Z toho u 14 pacientů (21,5 %) byla obě vyšetření pozitivní a u 44 (67,6 %) byla obě negativní. Rozdíl jsme prokázali u 7 pacientů (10,7 %). Tyto výsledky potvrzují nutnost odběru KD nejméně ze dvou míst u solidních nádorů.
Posouzení vztahu mezi léčebnými výsledky a přítomností MRD u pacientů 2. a 3. klinického stadia bude velmi důležité pro zařazení do rizikové skupiny. V současnosti jsou tito pacienti řazeni do skupiny středního rizika. Prokáže-li se jednoznačně, že MRD v době stanovení diagnózy významně zhoršuje přežití, měli by být považováni za vysoce rizikové. U pacientů, kteří mají v okamžiku stanovení diagnózy infiltrovanou KD nebo PK, můžeme sledovat postupný úbytek nádorových buněk během terapie (u leukémií se hodnotí rychlost úbytku nádorových buněk v KD). Pokud by se podobná závislost prokázala u NBL, mohli bychom předpovědět prognózu pacienta a u těch, kteří nereagují na standardní léčbu můžeme rychleji zareagovat změnou terapie, event. využitím jiných léčebných modalit.
Dále jsme vyšetřili nenádorové afekce a nádory jiného typu než NBL. U 24 vzorků nenádorových afekcí (lymfadenitidy, epidermoidní a kostní cystu, fibromatózu a hamartom) jsme neprokázali ani jednou zvýšené procento buněk nesoucích na svém povrchu sledovaný imunofenotyp. Vyšetřili jsme také 23 vzorků KD od 12 jedinců bez nádorového onemocnění, u kterých byla KD odebrána pro podezření na nádor, které se nepotvrdio. Spektrum diagnóz bylo obdobné (převažovaly záněty lymfatické tkáně). Žádný vzorek nebyl pozitivní.
Naší snahou bylo dále ověřit, zda je tato trojkombinace specifická pouze pro NBL. Celkem jsme vyšetřili 186 vzorků primárních maligních nádorů jiných než NBL. Zastoupeny byly všechny základní dětské solidní nádory. Nadpoloviční většina (56 %) exprimovala imunofenotyp CD45-/CD81+/CD56+ na více než 10 % nádorových buněk. Nejnižší výskyt exprese imunofenotypu CD45-/CD81+/CD56+ jsme detekovali u lymfomů (non-Hodgkinských i Hodgkinských) a u Ewingova sarkomu (průměr 5-18 %). Střední hodnoty se vyskytovaly u osteosarkomů a germinálních nádorů (průměr 19-25 %). Vysoké bylo u sarkomů měkkých tkání, nefroblastomu a nádorů CNS (průměr 34-40 %). Dosud nebyla publikována práce, která by potvrdila specificitu imunofenotypu CD45-/CD81+/CD56+ u neuroblastomu. V naší studii jsme prokázali, ž e tento imunofenotyp se nenachází na nenádorových buňkách, ale NBL není jediným dětským solidním nádorem, který ji exprimuje. Jako první jsme vyšetřili všechny nejčastěji se vyskytující skupiny primárních nádorů dětského věku. V každé jsme nalezli nádory s vysokou expresí tohoto imunofenotypu. Nádory lze rozdělit do tří skupin podle zastoupení a rozptylu exprese vyšetřovaného imunofenotypu:
1. lymfomy, Ewingůw sarkom – většina z nich měla expresi nízkou nebo žádnou, s velkou variací jednotlivých vzorků;
2. germinální tumory a osteosarkom mají střední hodnoty exprese i rozptylu;
3. nádory CNS, nefroblastomy a MMT mají zpravidla vysoký výskyt.

Tyto výsledky nás opravňují k závěru, že výše uvedený imunofenotyp není specifický pouze pro NBL a tedy ho nelze použít pro jeho průkaz. Je prokazován nejen u neuroblastomu, ale i u ostatních maligních nádorů. Proto je možné ho použít k odlišení od benigních afekcí. Nezbytnou podmínkou je ovšem prokázání vysoké exprese v primárním nádoru, protože se nádor od nádoru výrazně liší.
Ilustrací praktického využití vyšetření studovaného imunofenotypu u jiných nádorů než je neuroblastom mohou být dva naši pacienti s nádorem CNS. V první kazuistice se jedná o dvouleté dítě s 3 dny trvajícími teplotami, ustupujícími po podání antipyretik. Následovala ataka zvracení s křečemi a kvalitativní poruchou vědomí. Chlapec byl léčen 12 dní antibiotiky, celkový stav se zlepšil, ale přetvávala apatie. Proto absolvoval vyšetření mozku a páteřního kanálu magnetickou rezonancí s nálezem četných infiltrací měkkých plen s ložisky až 7 mm. V mozkomíšním moku byla opakovaně proteinorachie, atypické buňky nejasné etiologie, ale mikrobiologická vyšetření bylo negativní. S těmito nálezy byl pacient přeložen naši kliniku ke stanovení diagnózy. Zopakovali jsme odběr MMM s potvrzením proteinorachie bez zvýšení počtu monocytů, MMM byl sterilní, cytolog nezastihl nádorové buňky. Průtokovým cytometrem jsme prokázali 1 % buněk s expresí imunofenotypu CD45-/CD81+/CD56+. Vyslovili jsme podezření na nádorový proces, který se potvrdil biopsií. Patolog stanovil diagnózu astrocytomu 3. gradu. Pacient zahájil vzhledem k věku protinádorovou chemoterapii (u dětí do 3 let je kontraindikována radioterapie na oblast mozku). Po 4. cyklu chemoterapie zobrazovací vyšetření prokázala progresi na kterou pacient zemřel. Druhá popisuje dvouletého hocha s nauseou, zvracením a výraznou únavou. Neurologické a gastroenterologické vyšetření bylo bez patologického nálezu. Pro přetrvávání obtíží byl pacient hospitalizován a kompletně přešetřen. MRI mozku a pátřeního kanálu popsala mnohočetné infiltráty mozkových plen. V MMM cytolog identifikoval 15 % atypických buněk, které byly podezřelé z nádorového původu neobvyklou velikostí buněk i jader, zřetelnými jadérky a nepravidelnými mitózami. Cytometrem jsme prokázali 6 % buněk s expresí imunofenotypu CD45-/CD81+/CD56+. Tím jsme podpořili podezření na nádorový proces a patolog uzavřel histologické vyšetření biopsie jako PNET CNS. Zahájili jsme protinádorovou léčbu, nicméně po 1. sérii chemoterapie chlapec při rychlém zhoršování celkového stavu zemřel.
Nádory CNS prokazují vysokou expresi imunofenotypu CD45-/CD81+/CD56+ i její stabilní výskyt. Často je velmi nesnadné určit, zda se v MMM jedná o buňky zánětlivé nebo nádorové, zejména při větší příměsi leukocytů. Jak ukázují literární údaje i obě naše kazuistiky, přítomnost nádorových buněk v MMM je známkou velmi špatné prognózy.Cytometrické vyšetření MMM by tedy mohlo přispět k průkazu nádorových buněk a tím i k určení prognózy některých mozkových nádorů. Proto se chceme této skupině onemocnění v budoucnu více věnovat.
Závěrem kze shrnout, že vyšetřením vzorků primárních nádorů jsme doložili, že imunofenotyp CD45-/CD56+/CD81+ je u NBL stabilní. Nenalezli jsme rozdíl v expresi trojkombinace mezi jednotlivými klinickými stadii a potvrdili jsme, že tento imunofenotyp je vhodný pro průkaz MRD v KD. Jeho detekce průtokovým cytometrem je citlivější a specifičtější než morfologické vyšetření. Průtoková cytometrie není sice tak citlivá jako molekulárně biologické postupy (podle našich zkušeností 2-5 nádorových buněk na 103-6 zdravých), nicméně ve srovnání s nimi se jedná o velmi rychlou a poměrně levnou metodu.
Imunofenotypizací u nenádorových afekcí a primárních nádorů jiných, než NBL jsme prokázali, že imonofenotyp CD45-/CD56+/CD81+ se nevyskytuje ve tkáni nenádorových afekcí ani v KD pacientů s jiným, než nádorovým onemocněním. Vyšetřili jsme 186 vzorků primárních maligních nádorů jiných než neuroblastom, ty jsme rozdělili podle histologických typů a ve všech podskupinách jsme nalezli CD45-/CD56+/CD81+ pozitivní nádory (nejvyšší výskyt byl u nádorů mozku, nefroblastomu a MMT). Možnost praktického využití naznačují i výsledky vyšetření MMM u pacientů s nádorem CNS.

Literatura:

1. Eckschlager T a kol.: průtoková cytometrie v klinické praxi. Grada, Praha 1999
2. Komada Y et al.: Cancer. 1998;82:591-9
   
3. Nagai J et al.: J Pediatr Hematol Oncol. 2000;22:20-6
   
4. Tsang KS et al.: Cancer. 2003;97:2887-97

Práce vznikla za finanční podpory výzkumných záměrů MŠMT č. MSM 0021620813.