Konference: 2011 2. pražské mezioborové onkologické kolokvium
Kategorie: Onkologická diagnostika
Téma: Prezentace
Číslo abstraktu: 041
Autoři: prof. MUDr. Aleš Ryška, Ph.D.
Současný standard v morfologické klasifikaci karcinomu
plic
Současná klasifikace karcinomu plic rozeznává čtyři základní kategorie - malobuněčný karcinom, dlaždicobuněčný karcinom (SCC), adenokarcinom (AC) a velkobuněčný karcinom (LCC). Přes všechny novinky, které se v oblasti morfologické diagnostiky za poslední léta objevily, zůstává toto klasifikační schéma nezměněno po několik desítek let. Až do nedávné minulosti z terapeutického hlediska plně postačovalo odlišení malobuněčného karcinomu od skupiny ostatních - nemalobuněčných karcinomů (NSCLC). S nástupem nových terapeutických možností (nové druhy chemoterapie a cílené biologické léčby) vyvstala potřeba přesnější morfologické subklasifikace nemalobuněčných karcinomů, včetně detekce prediktivních markerů pro některé typy léčby.
WHO klasifikace karcinomů plic byla vytvořena pro hodnocení nádoru v chirurgických resekátech, její použití v případě drobných endobioptických vzorků či cytologických nátěrů je proto obtížné. Vzhledem k tomu, že nemalá část primárních plicních malignit je diagnostikována v relativně pozdním - a tedy inoperabilním - stadiu, je často jediným materiálem, který je k dispozici pro diagnostické vyšetření, právě cytologický a/nebo drobný histologický vzorek, získaný zpravidla pomocí endobronchiálního odběru, nebo transparietální punkcí. Čistě morfologické zařazení nádoru z takovéhoto odběru je možné jen v menšině případů. Výjimku tvoří pouze dobře diferencované nádory (pokud lze jednoznačně a spolehlivě identifikovat známky rohovění u SCC, nebo známky glandulární diferenciace u AC), kterých je však v případě pokročilých nádorů menšina. Případy spadající do kategorie nízce diferencovaných NSCLC jsou na čistě morfologické úrovni nerozlišitelné a v minulosti spadaly do kategorie LCC nebo NSCLC blíže nezařazeného (NOS). S rozvojem imunohistochemické diagnostiky je však v dnešní době možné velkou část nádorů z této podskupiny dále správně klasifikovat na základě detekce tkáňově specifických antigenů pomocí monoklonálních protilátek. V průběhu času se z poměrně širokého spektra různých antigenů, které lze ve tkáni vyšetřovat, vyselektovala skupina základních markerů - vedle antigenů typicky exprimovaných v neuroendokrinních nádorech (CD56, synaptophysin, chromogranin A) jsou to zejména vysokomolekulární cytokeratiny (nejčastěji CK 5/6, případně keratin 34betaE12), nízkomolekulární keratin CK7, marker progenitorových buněk p63 a růstový faktor TTF1. Jednotlivé subtypy nemalobuněčného karcinomu vykazují poměrně spolehlivě rozdílné profily imunofenotypu, což umožňuje jejich rozlišení - adenokarcinomy exprimují CK7 a TTF1 a jsou negativní v průkazu vysokomolekulárních keratinů CK5/6 a 34betaE12 a progenitorového markeru p63. Dlaždicobuněčné karcinomy vykazují inverzní imunofenotyp (CK7-, TTF1-, CK5/6+, 34betaE12+, p63+). Jen menšina nádorů s nepříznačným (překryvným) imunofenotypem tak zůstává v kategorii NSCLC NOS.
Pro stanovení správné histologické diagnózy je nezbytné splnění několika podmínek. Jedná se zejména o šetrný odběr dostatečného množství tkáně, bez výraznějšího mechanického zhmoždění vzorku, a dále její optimální fixace (bezodkladná, s dostatečným množstvím fixační tekutiny). Jen tak lze zajistit nejen vyšetření morfologie nádoru, ale i provedení celého spektra imunohistochemických detekcí.
Prekurzorem NSCLC je progenitorová buňka svým charakterem blízká nediferencovaným elementům bazální vrstvy bronchiální či bronchiolární výstelky. V případě adenokarcinomu hraje v patogenezi nádoru zásadní roli unikátní mutace (nejčastěji k-ras či EGFR), naproti tomu u dlaždicobuněčného karcinomu je dnes všeobecně přijímána teorie, že v jeho patogenezi je nezbytná sumace několika dílčích mutací v různých genech. Obecně je tak přijímána existence sekvence: hyperplázie bazálních buněk - dlaždicobbuněčná metaplázie - dysplastické změny - karcinom in situ - dlaždicobuněčný karcinom.
Nové možnosti molekulární diagnostiky nemalobuněčných karcinomů plic
Z hlediska molekulární patogeneze lze karcinomy plic rozdělit do několika skupin, kde první z nich tvoří nádory podmíněné mutací k-ras onkogenu (vyskytující se nejčastěji u kuřáků), druhou skupinou jsou pak nádory, jejichž vznik je podmíněn mutací genu pro receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR). Tyto dvě molekulární dráhy se takřka nikdy nevyskytují současně.
Mutace EGFR vzniká v několika exonech. Zatímco v exonu 19 se jedná o různé typy delecí (výskyt u 45% ze všech mutovaných), v exonu 21 jde o bodovou mutaci L858R (40-45% ze všech mutovaných). Méně často (cca v 5% mutovaných) jde o bodové mutace v exonu 18. Všechny výše zmíněné mutace mají aktivační charakter a vedou k trvalé aktivitě tyrozinkinázové domény receptoru bez ohledu na stimulaci příslušným ligandem a tím k permanentní stimulaci signální dráhy. Jejich přítomnost je tedy spojena s odpovědí na inhibitory tyrozinkinázové aktivity receptoru (TKI - erlotinib, gefitinib). Naproti tomu vzácné mutace v exonu 20 - nejčastěji bodová mutace T790M (5% všech mutovaných) - jsou spojeny s rezistencí na tuto léčbu.
Po zkušenostech s prediktivní diagnostikou u jiných nádorových onemocnění (karcinom prsu, karcinom tlustého střeva) byla po určitou dobu hledána nejvhodnější metoda pro výběr správné podskupiny pacientů vhodných pro léčbu TKI. Z testovaných metod (imunohistochemický průkaz EGFR, stanovení amplifikace genu pomocí fluorescenční in situ hybridizace, mutační analýza genu) se jako nejvalidnější ukazuje stanovení mutace. Metod na její průkaz existuje celá řada (klasická sekvenace, pyrosekvenace, denaturační kapilární elektroforéza, PCR v reálném čase, high resolution melting analýza), z nichž každá má své výhody a nevýhody.
Další molekulární dráhou se slibnou perspektivou využití v prediktivní diagnostice je translokace se vznikem fúzního genu EML4-ALK, která se vyskytuje u asi 6% NSCLC, častější je u nekuřáků a u pacientů s adenokarcinomem. Tato relativně malá podskupina nemalobuněčných karcinomů by dle prvních výsledků klinických studií mohla benefitovat z nového intracelulárního tyrozinkinázového inhibitoru crizotinibu. Mutaci je možné odhalit pomocí fluorescenční in situ hybridizace v histologických i cytologických vzorcích nádoru. V blízké budoucnosti lze očekávat zařazení detekce těchto molekulárních změn do rutinního diagnostického procesu - neznamená to ovšem, že by detekce mutací měla morfologickou diagnostiku nahradit, spíše bude sloužit jako její podstatný doplněk.
Hlavním problémem (ve srovnání např. s detekcí mutací k-ras u kolorektálního karcinomu) je velmi limitované množství materiálu, který je k dispozici (endobioptické vzorky nepatrné velikosti, příp. pouze cytologické nátěry) a dále nutnost provedení vyšetření v co nejkratším čase tak, aby bylo možno dle jeho výsledku rozhodnout o první linii systémové léčby. Tyto dva faktory budou klást velmi velké nároky na úzkou a bezproblémovou mezioborovou spolupráci mezi pneumology, patology, molekulárními genetiky a onkology.
Závěry pro praxi:
Poděkování
Práce byla podpořena výzkumným záměrem MZO 00179906.
e-mail: ryskaale@gmail.com
Současná klasifikace karcinomu plic rozeznává čtyři základní kategorie - malobuněčný karcinom, dlaždicobuněčný karcinom (SCC), adenokarcinom (AC) a velkobuněčný karcinom (LCC). Přes všechny novinky, které se v oblasti morfologické diagnostiky za poslední léta objevily, zůstává toto klasifikační schéma nezměněno po několik desítek let. Až do nedávné minulosti z terapeutického hlediska plně postačovalo odlišení malobuněčného karcinomu od skupiny ostatních - nemalobuněčných karcinomů (NSCLC). S nástupem nových terapeutických možností (nové druhy chemoterapie a cílené biologické léčby) vyvstala potřeba přesnější morfologické subklasifikace nemalobuněčných karcinomů, včetně detekce prediktivních markerů pro některé typy léčby.
WHO klasifikace karcinomů plic byla vytvořena pro hodnocení nádoru v chirurgických resekátech, její použití v případě drobných endobioptických vzorků či cytologických nátěrů je proto obtížné. Vzhledem k tomu, že nemalá část primárních plicních malignit je diagnostikována v relativně pozdním - a tedy inoperabilním - stadiu, je často jediným materiálem, který je k dispozici pro diagnostické vyšetření, právě cytologický a/nebo drobný histologický vzorek, získaný zpravidla pomocí endobronchiálního odběru, nebo transparietální punkcí. Čistě morfologické zařazení nádoru z takovéhoto odběru je možné jen v menšině případů. Výjimku tvoří pouze dobře diferencované nádory (pokud lze jednoznačně a spolehlivě identifikovat známky rohovění u SCC, nebo známky glandulární diferenciace u AC), kterých je však v případě pokročilých nádorů menšina. Případy spadající do kategorie nízce diferencovaných NSCLC jsou na čistě morfologické úrovni nerozlišitelné a v minulosti spadaly do kategorie LCC nebo NSCLC blíže nezařazeného (NOS). S rozvojem imunohistochemické diagnostiky je však v dnešní době možné velkou část nádorů z této podskupiny dále správně klasifikovat na základě detekce tkáňově specifických antigenů pomocí monoklonálních protilátek. V průběhu času se z poměrně širokého spektra různých antigenů, které lze ve tkáni vyšetřovat, vyselektovala skupina základních markerů - vedle antigenů typicky exprimovaných v neuroendokrinních nádorech (CD56, synaptophysin, chromogranin A) jsou to zejména vysokomolekulární cytokeratiny (nejčastěji CK 5/6, případně keratin 34betaE12), nízkomolekulární keratin CK7, marker progenitorových buněk p63 a růstový faktor TTF1. Jednotlivé subtypy nemalobuněčného karcinomu vykazují poměrně spolehlivě rozdílné profily imunofenotypu, což umožňuje jejich rozlišení - adenokarcinomy exprimují CK7 a TTF1 a jsou negativní v průkazu vysokomolekulárních keratinů CK5/6 a 34betaE12 a progenitorového markeru p63. Dlaždicobuněčné karcinomy vykazují inverzní imunofenotyp (CK7-, TTF1-, CK5/6+, 34betaE12+, p63+). Jen menšina nádorů s nepříznačným (překryvným) imunofenotypem tak zůstává v kategorii NSCLC NOS.
Pro stanovení správné histologické diagnózy je nezbytné splnění několika podmínek. Jedná se zejména o šetrný odběr dostatečného množství tkáně, bez výraznějšího mechanického zhmoždění vzorku, a dále její optimální fixace (bezodkladná, s dostatečným množstvím fixační tekutiny). Jen tak lze zajistit nejen vyšetření morfologie nádoru, ale i provedení celého spektra imunohistochemických detekcí.
Prekurzorem NSCLC je progenitorová buňka svým charakterem blízká nediferencovaným elementům bazální vrstvy bronchiální či bronchiolární výstelky. V případě adenokarcinomu hraje v patogenezi nádoru zásadní roli unikátní mutace (nejčastěji k-ras či EGFR), naproti tomu u dlaždicobuněčného karcinomu je dnes všeobecně přijímána teorie, že v jeho patogenezi je nezbytná sumace několika dílčích mutací v různých genech. Obecně je tak přijímána existence sekvence: hyperplázie bazálních buněk - dlaždicobbuněčná metaplázie - dysplastické změny - karcinom in situ - dlaždicobuněčný karcinom.
Nové možnosti molekulární diagnostiky nemalobuněčných karcinomů plic
Z hlediska molekulární patogeneze lze karcinomy plic rozdělit do několika skupin, kde první z nich tvoří nádory podmíněné mutací k-ras onkogenu (vyskytující se nejčastěji u kuřáků), druhou skupinou jsou pak nádory, jejichž vznik je podmíněn mutací genu pro receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR). Tyto dvě molekulární dráhy se takřka nikdy nevyskytují současně.
Mutace EGFR vzniká v několika exonech. Zatímco v exonu 19 se jedná o různé typy delecí (výskyt u 45% ze všech mutovaných), v exonu 21 jde o bodovou mutaci L858R (40-45% ze všech mutovaných). Méně často (cca v 5% mutovaných) jde o bodové mutace v exonu 18. Všechny výše zmíněné mutace mají aktivační charakter a vedou k trvalé aktivitě tyrozinkinázové domény receptoru bez ohledu na stimulaci příslušným ligandem a tím k permanentní stimulaci signální dráhy. Jejich přítomnost je tedy spojena s odpovědí na inhibitory tyrozinkinázové aktivity receptoru (TKI - erlotinib, gefitinib). Naproti tomu vzácné mutace v exonu 20 - nejčastěji bodová mutace T790M (5% všech mutovaných) - jsou spojeny s rezistencí na tuto léčbu.
Po zkušenostech s prediktivní diagnostikou u jiných nádorových onemocnění (karcinom prsu, karcinom tlustého střeva) byla po určitou dobu hledána nejvhodnější metoda pro výběr správné podskupiny pacientů vhodných pro léčbu TKI. Z testovaných metod (imunohistochemický průkaz EGFR, stanovení amplifikace genu pomocí fluorescenční in situ hybridizace, mutační analýza genu) se jako nejvalidnější ukazuje stanovení mutace. Metod na její průkaz existuje celá řada (klasická sekvenace, pyrosekvenace, denaturační kapilární elektroforéza, PCR v reálném čase, high resolution melting analýza), z nichž každá má své výhody a nevýhody.
Další molekulární dráhou se slibnou perspektivou využití v prediktivní diagnostice je translokace se vznikem fúzního genu EML4-ALK, která se vyskytuje u asi 6% NSCLC, častější je u nekuřáků a u pacientů s adenokarcinomem. Tato relativně malá podskupina nemalobuněčných karcinomů by dle prvních výsledků klinických studií mohla benefitovat z nového intracelulárního tyrozinkinázového inhibitoru crizotinibu. Mutaci je možné odhalit pomocí fluorescenční in situ hybridizace v histologických i cytologických vzorcích nádoru. V blízké budoucnosti lze očekávat zařazení detekce těchto molekulárních změn do rutinního diagnostického procesu - neznamená to ovšem, že by detekce mutací měla morfologickou diagnostiku nahradit, spíše bude sloužit jako její podstatný doplněk.
Hlavním problémem (ve srovnání např. s detekcí mutací k-ras u kolorektálního karcinomu) je velmi limitované množství materiálu, který je k dispozici (endobioptické vzorky nepatrné velikosti, příp. pouze cytologické nátěry) a dále nutnost provedení vyšetření v co nejkratším čase tak, aby bylo možno dle jeho výsledku rozhodnout o první linii systémové léčby. Tyto dva faktory budou klást velmi velké nároky na úzkou a bezproblémovou mezioborovou spolupráci mezi pneumology, patology, molekulárními genetiky a onkology.
Závěry pro praxi:
- Nemalobuněčný karcinom plic je heterogenní skupinou onemocnění
s rozdílnou molekulární patogenezí.
- Základní typy - velkobuněčný karcinom, dlaždicobuněčný karcinom
a adenokarcinom - lze morfologicky odlišit jen v části případů, a
to zejména tehdy, pokud je k dispozici limitované množství
materiálu (cytologický odběr, endobioptický či punkční odběr).
Vhodným doplňkem ke klasické histologii je použití
imunohistochemie, která umožní přesnější klasifikaci u značné části
nízce diferencovaných karcinomů.
- V nedaleké budoucnosti lze očekávat zařazení molekulární diagnostiky (detekci mutací EGFR, průkaz translokace ELK4-ALK) do rutinního diagnostického postupu.
Poděkování
Práce byla podpořena výzkumným záměrem MZO 00179906.
e-mail: ryskaale@gmail.com
Datum přednesení příspěvku: 28. 1. 2011
