CIELENÉ PROTEOMICKÉ PRÍSTUPY PRE ANALÝZU LUDSKÉHO NÁDOROVÉHO TKANIVA

Moderné metódy cielenej proteomiky založené na hmotnostnej spektrometrii nachádzajú významné uplatnenie v onkologickom výskume. Medzi tieto metódy patrí monitorovanie vybraných rekacií (SRM), jeho varianta vo vysokom rozlišení (p-SRM) a „Sequential Window Acquisition of all THeoretical spectra” (SWATH). Volba správnej cielenej metódy pre proteomický experiment závisí najmä od množstva kvantifikovaných proteínov v jednom behu a požadovanej citlivosti kvantifikácie. V našej práci sme porovnávali metódy SRM, p-SRM a SWATH na základe citlivosti, pomeru signálu k šumu (S/N), fold-change medzi ťažkou a lahkou variantou peptidu (FC), limitu detekcie (LOD) a limitu kvantifikácie (LOQ). S/N a FC bol porovnaný na vzorkách tkanivového lyzátu karcinómu prsníka (BrCa) s odlišnými klinicko-patologickými parametrami. Kvantifikovaných bolo 8 mTRAQ Δ0/Δ8 značených peptidov (16 prekurzorov) reprezentujúcich proteíny ACTN4, BGH3, COF1, GELS a POSTN. LOD a LOQ bol porovnaný na bunečnom lyzáte, kde bol pridaný izotopovo značený AQUA peptid pre absolutnu kvantifikáciu proteínu TMM33. SRM poskytovalo najintenzívnejší signál a bolo najcitlivejšie spomedzi porovnávaných metód, pomer S/N bol najvyšší pre p-SRM a najnižší pre SWATH. Porovnanie LOD ukázalo, že SRM je 2,2-krát citlivejšie než p-SRM na základe LOD a 1,2-krát na základe LOQ. Napriek najnižšiemu S/N vyniká metóda SWATH vysokou robustnosťou a možnosťou postakvizičnej extrakcie kvantitatívnych dát. To je velmi podstatné pre onkologický výskum, kde získané SWATH fingerprinty vzoriek umožňujú tvorbu tzv. digitálnych biobánk. Biologickú relevanciu výsledkov porovnávaných metód potvrdzujú hodnoty FC u mTRAQ značenej BrCa vzorky. Tie boli plne v súlade s výsledkami predošlej SRM štúdie na 96 BrCa vzorkách, kde proteín POSTN bol up-regulovaný u estrogén receptor pozitívnych nádorov, proteíny BGH3 a COF1 korelovali s vyšším nádorovým grade a zvýšená hladina proteínov ACTN4, GELS a POSTN bola spojená s metastázami do uzlín. Výsledky štúdie demonštrujú potenciál cielenej proteomiky pri vyhľadávaní, verifikácii a kvantifikácii nových biomarkerov a terapeutických cieľov v onkologickom výskume. Porovnanie kvantitatívnych parametrov SRM, p-SRM a SWATH uľahčí výber správnej kvantitatívnej metódy v závislosti na cieli proteomického experimentu.

Práce byla podpořena Grantovou agenturou ČR (projekt č. 14-19250S), státním rozpočtem České republiky (LO1413) a MZ ČR - RVO (MOÚ, 00209805).