Charakterizace intragenových delecí BRCA1 genu detekovaných metodou MLPA u pacientek s dědičnou predispozicí ke vzniku nádoru prsa a ovaria.

Úvod
Patogenní mutace v genu BRCA1 jsou nejčastější monogenně podmíněnou příčinou hereditární formy nádoru prsu a ovaria. Záchyt patogenních mutací u vysoce rizikových pacientů závisí kromě přísnosti výběrových kriterií také na zvolených postupech molekulárně genetického vyšetření. Jednou z možností podhodnocení záchytu u vysoce rizikových rodin může být přítomnost intragenového přeskupení, které nelze detekovat v rámci standardního screeningu založeného pouze na PCR metodách.

Podle údajů z literatury se množství nalezených genových přestaveb v BRCA1 genu v různých populacích značně liší. Záchyt se pohybuje se v rozmezí ~5-35% z celkového počtu detekovaných mutací v BRCA1 genu a detekovaná přeskupení jsou často populačně specifická. O spektru a frekvenci intragenových přeskupení v BRCA1 genu u pacientů s hereditární formou nádoru prsu a ovaria v české populaci doposud nebylo nic známo.

Soubor vyšetřených
152 nepříbuzných pacientek diagnostikovaných s hereditární formou nádoru prsu a/nebo ovaria, u kterých nebyla zachycena patogenní mutace po kompletním screeningu kódujících sekvencí BRCA1 a BRCA2 genu. Vybraný soubor pacientek splňoval následující kritéria: Diagnóza zhoubného nádoru prsu a/nebo ovaria u alespoň 3 případů příbuzných prvního stupně (u maternální dědičnosti) nebo druhého stupně (u paternální dědičnosti). Duplexní primární nádor byl posuzován jako 2 případy.
Molekulárně genetické vyšetření je prováděno u indikovaných případů po genetickém poradenství a podepsání informovaného souhlasu s vyšetřením.

Metody

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification)
Pro detekci intragenových přestaveb BRCA1 genu byl použit SALSA P002 BRCA1 MLPA kit (MRC-Holland, www.mlpa.com ), který umožňuje stanovení relativního počtu kopií všech BRCA1 exonů současně v jedné reakci (1). Fragmentační analýza byla prováděna na gelovém sekvenátoru ALF express II (Pharmacia) a na kapilárním sekvenátoru ABI310 (Perkin Elmer) ve spolupráci s Centrem molekulární biologie a genové terapie v dětské nemocnici v Brně.
Principem MLPA je hybridizace speciálně navržených sond specifických pro jednotlivé BRCA1 exony s genomovou DNA pacienta, jejich ligace a následná multiplex amplifikační reakce. Pouze sousední zligované sondy, které hybridizovaly s genomovou DNA, mohou být amplifikovány. Relativní plocha píků výsledných produktů je srovnána s relativní plochou píků kontrolních sond a odpovídá relativnímu počtu kopií cílové sekvence. Takto lze detekovat delece nebo duplikace velkých úseků DNA sekvence zahrnujících celé exony genu.

„Long-range“ PCR
Pomocí kitu „Expend long template PCR system“ firmy Roche byly amplifikovány úseky genomické DNA v rozsahu 5-14
Kb zahrnující oblast předpokládané delece. Použité primery byly navrženy užitím softwaru GeneFisher Interactive PCR primer design (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/).

Sekvenování
Místo delece je charakterizováno pomocí sekvenování na ALF express II (Pharmacia) sekvenátoru užitím Cy-5 Thermo Sequenase Dye Terminator kitu (Amersham).

Výsledky a diskuse
Pomocí MLPA analýzy bylo identifikováno 6 různých typů rozsáhlých intragenových delecí v BRCA1 genu a to u 9 vysoce rizikových rodin. Byla zachycena: delece exonů 1A+1B+2 (1x); delece exonů 5-14 (3x); delece části exonu 11 + exonu 12 (1x); delece exonů 18+19 (1x); delece exonu 20 (1x); delece exonů 21 + exonu 22 (2x). Všechny výše popsané delece byly potvrzeny metodou „Long-range PCR“ a v současné době jsou charakterizovány na úrovni genomické DNA pomocí sekvenování.
Rozsahově různé delece promotorové oblasti genu BRCA1 včetně exonů 1a, 1b a 2 již byly popsány u jiných populací (2, 3,
4). Delece detekovaná v české populaci je však od dříve zmíněných odlišná. Je zachytitelná pomocí publikovaných primerů, ale je o přibližně 2 Kb rozsáhlejší než delece popsaná ve francouzské populaci (3).
Delece v genu BRCA1 zahrnující exony 5-14, zatím nebyla publikována u jiné populace a byla zachycena u 3 nepříbuzných jedinců z vyšetřované skupiny.
Delece v genu BRCA1 zahrnující podstatnou část exonu 11 a exonu 12 zatím nebyla u jiné populace publikována. Byla zachycena u 2 sestřenic diagnostikovaných s karcinomem ovaria ve věku 34 a 47 let. Jedná se deleci 6,5 Kb genomické DNA, která ve svém důsledku způsobí odstranění minimálně 50% kodující sekvence proteinu.
Delece v genu BRCA1 zahrnující deleci exonů 18-19 a další zahrnující deleci exonu 20 již byly popsány u jiných populací (4, 5). Opět se ale podle našich výsledků v obou případech jedná o rozsahově a lokalizačně odlišné delece.
Poslední detekovaná delece v genu BRCA1 zahrnující exony 21-22 zatím nebyla u jiné populace publikována a zahrnuje oblast 3,6 Kb genomické DNA. Byla zachycena ve dvou nepříbuzných rodinách u 3 postižených žen diagnostikovaných s duplexními nádory prsu. Věk v době diagnózy byl u první pacientky v 25 a 45 letech; u druhé v 36 a 43 letech a u třetí v 30 a 42 letech.
U vyšetřované skupiny vysoce rizikových pacientek byly zachyceny u 5,8% původně BRCA1+2 negativních rodin. Intragenové delece nyní představují téměř 8% ze všech nalezených patogenních mutací v genu BRCA1 na našem pracovišti. Zvýšenou náchylnost k rozsáhlým rekombinacím lze v případě genu BRCA1 předpokládat na základě vysoké četnosti Alu-repetitivních sekvencí v jeho intronických oblastech a přítomnosti duplikace oblasti na 5’ konci genu BRCA1 obsahující pseudogen.

Závěr
Intragenové přeskupení v genu BRCA1 jsou přítomny v české populaci a frekvence jejich výskytu rozhodně není zanedbatelná. Ke standardnímu mutačnímu screeningu vycházejícímu z PCR reakce je vhodné u vysoce rizikových jedinců zařadit také vyšetření umožňující detekci velkých genomických delecí/duplikací zahrnujících celé exony genu.
Je-li zvolena MLPA analýza, musí být před vydáním závěrečné zprávy výsledky ověřeny jinou nezávislou metodou a přesně charakterizovány. Pouze jasně interpretovatelné výsledky lze využít v genetickém poradenství a následně v klinické praxi.


Literatura

1. Schouten JP, McElgunn CJ, Cathal J, et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucl Acids Res 2002; 30:e57.
   
2. Swensen J, Hoffman M, Skolnick MH, Neuhausen SL. Identification of a 14kb deletion involving the promoter region of BRCA1 in a breast cancer family. Hum Mol Genet 1997; 6 (9):1513-1517.
   
3. Puget N, Gad S, Perrin – Vidoz L, et al. Distinct BRCA1 rerrangements involving the BRCA1 pseudogene suggest the existence of a recombination hot spot. Am J Hum Genet 2002; 70: 858-865.
   
4. Montagna M, Dalla Palma M, Menin C, et al. Genomic rearrangements account for more than one-third of the BRCA1 mutations in northern Italian breast/ovarian cancer families. Hum Mol Genet 2003; 12 (9):1055-1061.
   
5. Belogianni I, Apessos A, Mihalatos M, et al. Characterization of a novel large deletion and single point mutations in the BRCA1 gene in a Greek cohort of families with suspected hereditary breast cancer. BMC Cancer 2004; 4: 61.
   
   Práce byla podpořena granty MZČR MZ00020980501 a IGA MZČR NR/8213-3.