ANALÝZA STRUKTURNÍCH ZMĚN PROTEINU REPTIN PO INTERAKCI S ATP METODOU VODÍK/ DEUTERIOVÉ VÝMĚNY VE SPOJENÍ S HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ

Východiska:

Protein Reptin je esenciální pro řadu buněčných funkcí, mezi které patří remodelace chromatinu, regulace transkripce, detekce poškozené DNA a její opravení a také skládání proteinových a ribonukleoproteinových komplexů. Tuto širokou škálu funkcí může plnit díky svému zapojení do různých proteinových komplexů. Byla popsána i jeho interakce jak s transkripčními faktory c-Myc a ß-katenin, které patří mezi protoonkogeny, tak i s tumor supresorovým proteinem p53. Zvýšená exprese Reptinu byla detekována v buňkách hepatocelulárního karcinomu, kolorektálního karcinomu, karcinomu ledvin a plic, což jen dále poukazuje na jeho významnou roli v nádorové biologii. V proteinových komplexech se Reptin nachází zejména v hexamerické formě a jeho aktivita závisí na vazbě a hydrolýze ATP a také na interakci se signálními proteiny. Bližší porozumění strukturním změnám, které Reptin podstupuje po vazbě a následné hydrolýze ATP, by mohlo přispět k objasnění jeho funkce v daných proteinových komplexech a pochopení jeho role v onkogenezi.

Materiál a metody:

K měření vlivu ATP na strukturu proteinu Reptin a na jeho oligomerizaci byla použita metoda vodík/deuteriové výměny ve spojení s analýzou hmotnostním spektrometrem. Tato metoda dokáže detekovat dynamické změny ve struktuře proteinu v závislosti na přítomnosti ligandu a také protein-proteinové a protein-ligandové interakce. Protein Reptin byl inkubován 1 hod s ATP nebo jeho nehydrolyzovatelnou variantou AMP-PNP. Výměnná reakce vodíků byla zahájena přidáním pufru s D₂O a ve stanovených intervalech zastavována okyselením a zamražením vzorků v tekutém dusíku.

Výsledky:

Přítomnost ATP i AMP-PNP snížila selektivně deuterace v oblasti ATP-kapsy, což potvrzuje interakci daného nukleotidu s Reptinem v této oblasti. V hmotnostních spektrech Reptinu byly identifikovány bimodální izotopové obálky, které mohou představovat dva různé stavy proteinu lišící se mírou inkorporace deuterií. Naproti tomu v hmotnostních spektrech mutantního Reptinu Y340A, který netvoří oligomery, bimodální obálky detekovány nebyly.

Závěr:

Naše výsledky potvrzují interakci ATP s ATP-kapsou Reptinu a ukazují, že přítomnost ATP ovlivňuje oligomerický stav Reptinu.

Práce je podpořena projekty MŠMT - NPU I - LO1413, MZ ČR - RVO (MOÚ, 00209805) a GAČR 16-20860S.