Analýza obsahu metalothioneinu u pacientů s nádorovým onemocněním

Úvod:

Každým rokem je ve světě diagnostikováno více než 10 miliónů nových případů nádorových onemocnění. Zhoubná onemocnění mají za následek úmrtí více než 6 milionů lidí v rozvinutých zemích (první místo žebríčku stále náleží kardiovaskulárním onemocněním). Ministerstvo zdravotnictví ČR a Česká onkologická společnost vyhlásili program zaměřený na pokles výskytu zhoubných onemocnění v české populaci. Značná pozornost by měla být věnována především (ve smyslu Národního onkologického programu ČR);
i) primární prevenci a výchově k udržení zdraví
ii) „screeningovým“ programům využívajícím nových moderních technologií
iii) zlepšení časné diagnostiky mezi něž náleží i nové potencionální markery
iv) vytvoření sítě specializovaných pracovišť
v) podpora výzkumných projektů.
Řada výzkumných skupin hledá vhodné markery pro nádorovou diagnostiku, anebo pro sledování efektivity použité protinádorové léčby.Nedávno bylo publikováno, že množství metalothioneinu (MT) se mění u řady zhoubných nádorů (nádory prsu, kůže a pankreatu a další). Metalothioneiny patří do skupiny intracelulárních, nízkomolekulárních, na cystein velmi bohatých proteinů (obsah Cys až 30 % v molekule proteinu) o molekulové hmotnosti od 6–10 kDa. Je pravděpodobné, že změny v expresi MT mohou být případným prognostickým markerem u celé řady zhoubných nádorových onemocnění. Z tohoto důvodu je potřebné studovat změny MT u pacientů se zhoubnými nádory pomocí jednoduchých a rychlých analytických postupů.

Cíl.

Práce je zaměřena na studium obsahu metalothioneinu u pacientů s nádorovým onemocněním.

Materiály a metody

Klinický materiál: V průběhu prvního pololetí roku 2005 byla získána séra od pacientů léčených pro zhoubný nádor na různých odděleních FN Motol. Pokud to bylo možné, byly sledovány základní biochemické ukazatele (ALP, AST, ALT, GMT a nádorový marker CA 15–3). Krevní séra byla ihned zmražena na -20 °C do doby jejich dalšího zpracování. Celkem bylo analyzováno 70 sér pacientů.

Elektroanalytické stanovení metalothioneinu pomocí Brdičkovy reakce metodou AdTS DPV Vzorky byly analyzovány na přístroji AUTOLAB Analyser (EcoChemie, Netherlands) ve spojení s VA- -Stand 663 (Metrohm, Switzerland) v klasickém tříelektrodovém uspořádání. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm²; referenční elektrodou byla Ag/Ag- Cl/3M KCl a pomocnou grafitová elektroda. Základní elektrolyt (1 mmol.dm^-3 Co(NH₃)₆Cl₃ a 1 mol.dm^-3 amonný pufr; NH³(aq) + NH₄Cl, pH = 9,6) byl po každých 5 analýzách vyměněn. AdTS DPV parametry byly následující: počáteční potenciál -0,6 V, konečný potenciál -1,6 V, modulační čas 0,057 s, časový interval 0,2 s, potenciálový krok 1,05 mV/s, modulační amplituda 250 mV, Eads = 0 V, teplota 0 °C.

Výsledky:
Před více než sedmdesáti lety objevil Rudolf Brdička katalytické vylučování vodíku ze základního elektrolytu v přítomnosti proteinů. V této práci jsou popsány prvotní experimentální výsledky stanovení obsahu metalothioneinu u pacientů se zhoubnými nádory (v různém stadiu a fázi onemocnění a léčby) pomocí Brdičkovy reakce. Vzorky krevních sér byly odebírány v průběhu prvního pololetí roku 2005, a pokud to bylo možné, byly charakterizovány z hlediska základních biochemických ukazatelů. Analýza MT byla provedena námi modifikovaným elektroanalytickým postupem (diferenční pulzní voltametrie v kombinaci s adsorptivní přenosovou voltametrií). Vzorek byl adsorbován z 5 µl kapky na povrch pracovní elektrody, poté byl přebytečný roztok z povrchu elektrody omyt a modifikovaná elektroda byla umístěna do měřící nádobky. Na získaných voltamogramech byl pozorován rozdílný průběh záznamu u pacientů s různými zhoubnými nádory. Nejvýraznější katalytické signály byly pozorovány u pacientů se zhoubným nádorem tlustého střeva. V naší předešlé práci jsme se pokusili určit průměrnou hladinu MT u zdravých lidí, která kolísá okolo 0,6±0,3 µmol.dm^-3 MT. Zjistili jsme, že u pacientů s nádory prsu byl průměrný obsah MT 1,6 µmol.dm^-3. V případě pacientů s melanomem byla průměrná hladina MT 1,97 µmol.dm^-3. U pacientů se zhoubným nádorem tlustého střeva byla průměrná hladina MT 3,2 µmol.dm^-3, tedy 2krát vyšší než u pacientů s nádorem prsu. Vyšší hladina MT byla pozorována u všech pacientů s vyššími hodnotami jaterních enzymů. Velmi zajímavá shoda byla také pozorována mezi hodnotou nádorového markeru CA 15-3 a hladinou MT. Vztahu nádorového markeru CA 15-3 a hladiny MT se bude věnovat naše další práce.

Závěr:
Elektroanalytických technik je možné využít pro analýzu významných biologicky aktivních proteinů u pacientů se zhoubnými nádory. Ze získaných experimentálních výsledků je zřejmé, že hladina sérového MT výrazně stoupá u většiny pacientů se zhoubnými nádory. Navíc u pacientů se zhoubným nádorem tlustého střeva a melanomem byl nárůst hladiny MT výrazně vyšší ve srovnání s pacienty se zhoubným nádorem prsu. Poděkování. Tato práce byla podpořena granty: GA ČR 525/04/P132 a RASO 8/2005.

Literatura

1. R. Kizek et. al.: Anal. Chem. 73 (2001) 4801.
2. M. Strouhal et. al.: Bioelectrochemistry 60 (2003) 29.
3. L. Trnkova et. al.: Bioelectrochemistry 56 (2002) 57.
4. R. Prusa et. al.: Clin. Chem. 50 (2004) A28.
5. R. Prusa. et al.: Clin Chem. 51 (2005) A56.
6. J. Petrlova et al.: Klinicka Onkologie (2005) odesláno.
7. J. Zelena et al.: Klinická Onkologie 17 (2004) 190.
8. R. Kizek et al.: Klin. Biochem. Metab. 12 (2004) 72.
9. R. Kizek et al.: Chem. Listy 98 (2004) 166.
10. E. Palecek et. al.: Anal. Chem. 76 (2004) 5930.