Konference: 2011 XXXV. Brněnské onkologické dny a XXV. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie
Téma: Postery
Číslo abstraktu: 278p
Autoři: Mgr. Jana Stránská, Ph.D.; Mgr. Sylwia Jančík (Wieczek); Veronika Holinková, DiS.; Miroslava Rabčanová; doc. MUDr. Marián Hajdúch, Ph.D.
Úvod
Rakovina tlustého střeva (CRC) je třetí nejběžnější příčina úmrtí na maligní onemocnění s výskytem téměř milionu případů ročně (CA Cancer J Clin (2005) 55(2):74-108). Léčba CRC protilátkovými inhibitory (mAb) Receptoru epidermálního růstového faktoru (EGFR), např. cetuximab a panitumumab, má jako hlavní negativní prediktor mutaci genu KRAS (Cancer Res (2007) 67(6):2643-2648). Nicméně i u KRAS standardních (wildtype) genotypů může být účinnost anti-EGFR mAb snížena, např. mutací genu BRAF (přibližně 10%) (Nature (2002) 418(6901):934-937). BRAF kóduje kinasu umístěnou v EGFR signální dráze za KRAS.
Nejčastěji pozorovanou mutací BRAF je missense mutace DNA vedoucí k nahrazení aminokyseliny valinu za kyselinu glutamovou (V600E), která vede k aberantní aktivaci MEK-ERK dráhy a CRC karcinogenezi. Předpokládá se, že v případě nádorů bez mutace (wt) genu KRAS může mít mutace BRAF prediktivní/prognostickou roli v odpovědi na anti-EGFR léčiva (J Clin Oncol (2008) 26(35):5705-12). Vzhledem k tomu, že mutace v BRAF má prediktivní význam i u melanomů, zavádíme vlastní metodu BRAF genotypizace.
Metody
Genomová DNA byla izolována ze 49 parafinových řezů za použití komerčních souprav NucleoSpin® Tissue XS kit (NS; MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren, Německo) a MagCore® Genomic DNA Tissue kit (MC; RBCBioscience, Xindian City, Taiwan). V extrahované DNA s wt statusem genu KRAS (TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit, DxS Limited, Manchester, VB) byly analyzovány mutace V600E genu BRAF za použití komerční soupravy BRAF StripAssayTM (ViennaLab Diagnostics GmbH, Vídeň, Rakousko). Paralelně bylo vyšetření provedeno ‘home-made’ systémem real-time PCR. Námi použitý systém využívá metodu real-time PCR se specifickými primery pro mutovanou část genu BRAF a interkalačním činidlem EvaGreen (FAM kanál). Zároveň je v reakci přítomna univerzální interní kontrola amplifikace – specifické primery a TaqMan sonda (HEX-BHQ1, JOE kanál) pro gen globin. Vyhodnocení přítomnosti mutace BRAF je provedeno pomocí analýzy amplifikační křivky a křivky tání amplikonů, kdy se amplikon globinu a BRAFu liší o 8 °C.
Výsledky a závěr
Srovnali jsme frekvenci výskytu mutací genu BRAF v naší populaci CRC pacientů s publikovanými údaji, srovnali jsme časové a finanční náklady, specificitu a senzitivitu naší metody ve srovnání s komerčním kitem. Naši metodu považujeme za vhodné ověření výsledků získaných komerčním kitem.
Infrastrukturální část projektu (Ústav molekulární a translační medicíny) byla podpořena Operačním programem Výzkum a vývoj pro inovace (projekt CZ.1.05/2.1.00/01.0030).
Rakovina tlustého střeva (CRC) je třetí nejběžnější příčina úmrtí na maligní onemocnění s výskytem téměř milionu případů ročně (CA Cancer J Clin (2005) 55(2):74-108). Léčba CRC protilátkovými inhibitory (mAb) Receptoru epidermálního růstového faktoru (EGFR), např. cetuximab a panitumumab, má jako hlavní negativní prediktor mutaci genu KRAS (Cancer Res (2007) 67(6):2643-2648). Nicméně i u KRAS standardních (wildtype) genotypů může být účinnost anti-EGFR mAb snížena, např. mutací genu BRAF (přibližně 10%) (Nature (2002) 418(6901):934-937). BRAF kóduje kinasu umístěnou v EGFR signální dráze za KRAS.
Nejčastěji pozorovanou mutací BRAF je missense mutace DNA vedoucí k nahrazení aminokyseliny valinu za kyselinu glutamovou (V600E), která vede k aberantní aktivaci MEK-ERK dráhy a CRC karcinogenezi. Předpokládá se, že v případě nádorů bez mutace (wt) genu KRAS může mít mutace BRAF prediktivní/prognostickou roli v odpovědi na anti-EGFR léčiva (J Clin Oncol (2008) 26(35):5705-12). Vzhledem k tomu, že mutace v BRAF má prediktivní význam i u melanomů, zavádíme vlastní metodu BRAF genotypizace.
Metody
Genomová DNA byla izolována ze 49 parafinových řezů za použití komerčních souprav NucleoSpin® Tissue XS kit (NS; MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren, Německo) a MagCore® Genomic DNA Tissue kit (MC; RBCBioscience, Xindian City, Taiwan). V extrahované DNA s wt statusem genu KRAS (TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit, DxS Limited, Manchester, VB) byly analyzovány mutace V600E genu BRAF za použití komerční soupravy BRAF StripAssayTM (ViennaLab Diagnostics GmbH, Vídeň, Rakousko). Paralelně bylo vyšetření provedeno ‘home-made’ systémem real-time PCR. Námi použitý systém využívá metodu real-time PCR se specifickými primery pro mutovanou část genu BRAF a interkalačním činidlem EvaGreen (FAM kanál). Zároveň je v reakci přítomna univerzální interní kontrola amplifikace – specifické primery a TaqMan sonda (HEX-BHQ1, JOE kanál) pro gen globin. Vyhodnocení přítomnosti mutace BRAF je provedeno pomocí analýzy amplifikační křivky a křivky tání amplikonů, kdy se amplikon globinu a BRAFu liší o 8 °C.
Výsledky a závěr
Srovnali jsme frekvenci výskytu mutací genu BRAF v naší populaci CRC pacientů s publikovanými údaji, srovnali jsme časové a finanční náklady, specificitu a senzitivitu naší metody ve srovnání s komerčním kitem. Naši metodu považujeme za vhodné ověření výsledků získaných komerčním kitem.
Infrastrukturální část projektu (Ústav molekulární a translační medicíny) byla podpořena Operačním programem Výzkum a vývoj pro inovace (projekt CZ.1.05/2.1.00/01.0030).
Datum přednesení příspěvku: 21. 4. 2011
