ALFA-LAKTALBUMIN – INSPIRACE PRO ONKOLOGII?

Konečným cílem v léčení rakoviny je léčebný prostředek, který výlučně ničí buňky nádorové a neohrožuje normální buňky lidského těla. Nejúspěšnějším postupem v tomto smyslu je zatím chirurgické odstranění původního (primárního) rakovinného nádoru v počátečním stadiu choroby. Horší je situace ve stadiu pozdějším, když došlo již k rozsevu nádorových buněk do vzdálenějších míst organizmu. I zde dosáhlo dnešní lékařství značných úspěchů pomoci léčby zářením a chemoterapií. U obou metod je však velkou komplikací možné postižení i zdravé tkáně nebo orgánů. Zůstává tedy i dnes ideálem látka, která po vpravení do organizmu „vyhledává“ si sama pouze buňky nádorové, tedy buňky, které nespolupracují, tělu „odcizené“ a tělo ohrožující.
V roce 1995 zkoumali švédští badatelé¹⁾ účinky lidského mateřského mléka na přilnavost bakterií k povrchu maligních buněk jedné z linií lidské plicní rakoviny. Původně měla jejich studie přispět k objasnění dříve již známé skutečnosti, že mateřské mléko má výrazné baktericidní účinky. Zabíjí především ty mikroby, které dříve ohrožovaly matku, a po porodu by mohly ohrozit kojence. Ke svému velkému údivu autoři zjistili, že mateřské mléko v krátké době ničí nejen bakterie, ale i nádorové buňky, že některá z látek, onsažená v mateřském mléku, spouští u nich molekulární mechanizmus, který vede k jejich sebezničení klidnou, nezánětlivou cestou - apoptózou.
O alfa-laktalbuminu(aLA) jsme věděli již dříve, že patří do skupiny látek, jejichž přítomnost v určitém enzymovém komplexu způsobuje výraznou změnu jeho původní biologické funkce. V sekreční buňce laktující mléčné žlázy, jako složka B, je aLA jedna ze dvou bílkovinných složek enzymatického systému nezbytného pro tvorbu laktózy. Složkou A jje v tomto systému enzym galaktosyltransferáza, enzym, který především v buňce nelaktující, klidové mléčné žlázy, podobně jako i v buňkách jiných orgánů, je využíván samostatně (tedy bez složky B) pro stavbu molekul glykoproteinového typu. Tento druh bílkovin se liší od běžné molekuly bílkoviny jako řetězce specifického sledu většího počtu aminokyselin tím, že větší nebo menší procento struktury tvoří také specifické cukry (sacharidy) vázané především na asparagin, serin, treonin nebo hydroxylysin. K tomuto typu bílkovin patří velká většina funkčně velmi různorodých a vysoce výkonných bílkovin sérových, hormonálních a složek buněčných membrán. Pro naše úvahy je důležité zjištění, že většina nádorových buněk se podstatně od normálních buněk stejného tkáňového typu liší. Povrch nádorových buněk má jiný „les polysacharidových antén“ trčících z buněk; les hustší a kvalitativně odlišný od buněk normálních, netransformovaných.
V mateřském mléku zjistili tedy švédští badatelé jinou formu aLA, formu multimérní (mm-aLA). Posledních pět let dvacátého století věnovali tito badatelé rozluštění strukturální záhady této formace. V roce 1999 publikovali výsledky studie, která charakterizovala bílkovinný komplex lidského mléka, indukující apoptózu u nádorových buněk, ale šetří buňky zdravé. Ukázalo se, že aktivní frakce je směsí, ve které vedle molekul aLA (monomeru) existují i jeho formy multimerní (resp. oligomerní). Oligomerní varianty aLA o molekulární hmotnosti, která je násobkem hmotnosti monomeru aLA ( tedy ≈ 30 kDa a vyšší ), byly stabilní vůči rozpadu na monoméry. V podstatě si skladebné prvky těchto variant uchovaly původní primární a sekundární strukturu, změna nastala však v jejich organizaci prostorové struktury terciární struktury). Výsledky srovnání s nativním monomerním ALA a s ALA ve tvaru „molten globule „ ²⁾ svědčí o možnosti, že při oligomerizaci dochází ke změnám směrem ke stavu podobnému „molten globule“. Současně podali autoři důkaz, že existují zajímavé rozdíly v biologických vlastnostech a působení molekuly alfa-laktalbuminu různého stupně „sbalení“ nebo „svinutí.“
Během syntézy a transportu bílkovin v lidských buňkách dochází k řadě konformačních změn. Domnívali jsme se, že specifičnost sekvence aminokyselin a termodynamické síly nutí bílkovinu měnit svůj tvar a zaujímat takovou konformaci, která vykazuje nejnižší volnou energii. V posledních deseti letech se tento klasický náhled ale poněkud změnil, poněvadž se ukázalo, že bílkovina zaujímá často různé stabilní konformace, závisející i na tom, které kinetické signální cesty následují.
Podrobný výzkum molekulárního podkladu mechanizmu působení mm-aLA si vyžádal vyšetření interakcí mezi mm-aLA a různými buněčnými organelami za použití konfokálního mikroskopu. Ukázalo se, že tento komplex se hromadí relativně rychle v jádře buněk, podléhajících následovně apoptóze; hromadí se zde spíše než v cytozolu, vezikulách nebo v endoplazmatickém retikulu, včetně Golgiho komplexu! U buněk k apoptóze rezistintních k tomuto hromadění nedošlo! Příjem do jádra se odehrává zřejmě přes póry jaderné membrány a není závislý na iontech vápníku. Přítomnost mm-aLA v jádře a přítomnost vápníkových jontů byla však kritická pro vyvolání fragmentace DNA.
Signalizační cesta apoptózy vyvolaná mm-aLA se liší od již dříve známých spouštěčů především tím, že mm-aLA prochází membránou, cytozolem a vstupuje do jádra, kde vyvolává DNA fragmentaci přímým účinkem v této organele!
Tým biologů a biochemiků univerzity v Lundu pokračoval proto ve výzkumu multimerního aLA pokusy na monoméru aLA. Švédští badatelé vycházeli z představy, že pokud se různě sbalené varianty monomeru skutečně v biologických aktivitách liší, pak by mělo být možné přeměnit neúčinný nativní α-laktalbumin na aktivní, apoptózu indukující formu, pouhou změnou konformace. Výchozím materiálem byl α-lactalbumin získaný ze syrovátky lidského mléka a syntetická rekombinantní bílkovina, exprimovaná v Escherichia coli. Novou studií skutečně potvrdili svou hypotézu a definovali i podmínky k docílení strukturálních a funkčních změn, charakterizujících formu, kterou nazvali HAMLET³⁾, formu usmrcující nádorové buňky. Zjistili,že HAMLET sestává z částečně nesbaleného α-laktalbuminu, který integroval kofaktor, stabilizující nabytou konformaci. Tento kofaktor identifikovali: Je to specifická nenasycená mastná kyselina – C18:1.
HAMLET vyvolává změnu prostupnosti mitochondriální membrány (MPT). Důsledkem je ztráta potenciálu mitochondriální membrány (ΔΨ_m) , zbobtnání mitochondrie a únik některých bílkovin z mitochondriálního mezimembránoho prostoru. Tyto změny byly závislé na vápníkových iontech a dalo se jim zabránit inhibitorem MPT- cyklosporinem-A. Na základě výsledků svých studií vyslovili švédští autoři pracovní hypotézu, že HAMLET vyvolává v mitochondriích změnu permeability s následným únikem cytochromu c, který v transformované buňce vede k aktivaci kaspázové kaskády a k apoptotické smrti“.
Švédská skupina biologů v Lundu pokračovala dále systematicky ve vyšetřování molekulárního mechanizmu působení HAMLET-a. Zajímalo ji, zda rozvolnění prostorové struktury ALA je dostačujícím impulzem pro vyvolání bunéčné smrti. Došli k závěru, že částečné rozvolnění aLA je nezbytné, ale ne dostačující pro iniciaci signálu k zahájení procesu buněčné smrti.. Aktivita komplexu HAMLET je dána jak složkou bílkovinnou, tak i lipidovým kofaktorem. Funkční vazebné místo pro vápníkové jonty není pro přeměnu (konverzi) aLA na aktivní komplex, způsobující apoptózu, nutné. Lipidový faktor stabilizuje pozměněnou terciární strukturu (nové sbalení), aniž by to interferovalo s místem pro vápník.
Přeměna ALA na komplex HAMLET a jeho účinky na linie nádorových buněk zvýšila naději na reálné uplatnění objevu v terapii nádorů. Klinické studie na lidech začaly velmi opatrně. Na univerzitě v Lundu zkoušel tým, sestavený ze členů Ústavu laboratorní mediciny a Kliniky dermatologie a venerologie, účinek topické (místní) aplikace komplexu HAMLET na kožní virové bradavice - papilomy, aby podal důkaz, že opravdu postihuje apoptóza pouze transformované buňky. V randomizované, placebem kontrolované, dvojitě slepé studii měřili u 40 nemocných objem 166 kožních papilomů, rezistentních k léčení konvenčními způsoby. Výsledky jsou velmi nadějné. Rozdíly mezi hodnotami zmenšení papilomů léčených „placebem“ a léčených komplexem HAMLET byly významné, účinek byl trvalý. Po léčení byli nemocní sledováni 1,8 až 2,8let. Časem všechny bradavičné léze po aplikaci komplexu HAMLET vymizely. Nebylo rozdílu mezi skupinami nemocných s normální a potlačenou imunitou. Ve zdravé kůži kolem papilomu nebyla zjištěna patologická reakce.