Klin Onkol 2005; 18(2): 64-68.
Souhrn:
Úvod: Mechanismy buněčné odpovědi na inhibici DNA syntézy methotrexátem zůstávají stále do jisté míry ne zcela objasněné. V této práci ukazujeme, že při chemoterapii naivních lymfoblastů izolovaných z kostní dřeně od pacientů trpících akutní lymfoblastickou leukémií kultivovaných ex vivo s methotrexátem dochází ke změnám hladiny proteinu p53 i exprese některých genů p53 regulujících i regulovaných.
Metody: Sledovali jsme indukci proteinu p53 a p53 signálních genů po 24 h ex vivo inkubaci s methotrexátem u naivních lymfoblastů izolovaných z kostní dřeně . U čtyř pacientů byla provedena imunocytochemická analýza p53 a pomocí cDNA GEArray membrán (www.superarray.com) byly stanoveny změny v expresi genů, které jsou součástí p53 signálních drah.
Výsledky: Ex vivo experimenty byly prováděny v bezfolátovém mediu, k němuž byl přidán 5-methyltetrahydrofolát na konečnou koncentraci 25 nmol/l, s cílem paralelizovat podmínky lidské plasmy. Celkově bylo zjištěno mírné utlumení transkripční aktivity u ex vivo kultivovaných lymfoblastů po podání methotrexátu. U všech čtyř pacientů, u nichž byla imunocytochemicky pozorovatelná p53 indukce, docházelo prokazatelně ke snížení exprese některých genů uplatňujících se při regulaci buněčného cyklu jako jsou CDC2 (cdk1), SP1, NDRG. Naopak v expresi genů apoptotických drah nebyly detekovány žádné signifikantní změny. V případě genů APEX (Ref-1) a ARF (p16ink4), jejichž produkty se uplatňují při interakcích s p53, případně ovlivňují jeho expresi a stabilitu, byly po přídavku methotrexátu rovněž detekovány signifikantní změny v expresi. Z genů, jejichž produkty mají schopnost modifikovat p53, bylo prokázáno snížení exprese po působení methotrexátu, případně roskovitinu, především u genu SIRT1. U dvou pacientů (B-ALL) pak docházelo oproti kontrole k výraznému snížení exprese genu ATM, významného transkripčního faktoru negativně regulujícího buněčný cyklus. Dále byly u všech pacientů zaznamenány inter-individuální změny v expresi genů CSNK1A1, CSNK2, HIPK2 a JNKK2.
Závěr: Naše výsledky naznačují, že hladina exprese genů se při srovnání B a T typu malignity, i v rámci jednoho typu nemusí přesně shodovat při jinak stejné léčbě za identických podmínek. Determinace změn v expresi p53 signálních genů a indukce samotného proteinu p53 může být důležitou pomůckou při stanovení individuální míry „funkční“ odpovědi na „high-dose“ terapii methotrexátem. Tyto předběžné výsledky by kromě tradičně známého inhibičního vlivu na DHFR měly rozšířit i současné celkové znalosti o působení methotrexátu na buněčné úrovni. Podařilo se nám identifikovat zhruba 11 genů, u kterých docházelo ke změně v expresi u všech sledovaných pacientů. Takto vytipované geny a jejich produkty budou podrobeny další funkční analýze na vhodných modelových systémech s cílem nalézt souvislost mezi expresí daných genů, jimi kódovaných proteinů, typem onemocnění a mechanismem účinku cytostatika.
