Analytické nástroje pro sledování komplexů platiny.

Klíčová slova: deriváty cysplatiny, fragment metalothioneinu, interakce

Úvod

Jedním z důležitých mezníků v onkologické léčbě bylo objevení protinádorových vlastností cisplatiny (komplex cis-diaminodichloroplatnatý – cis-[Pt(NH3)2Cl2]) (Rozencweig, et al.). Účinky tohoto komplexu jsou i nadále velmi studovány (Raymond, et al., Fuertes, et al.). Cisplatina se v dnešní době používá jednak jako samotná, anebo v kombinaci s dalšími léčivy zejména v léčbě rakoviny močového měchýře, vaječníků, hlavy a krku, varlat a plic (Harper, et al.). Biologická aktivita tohoto platnatého komplexu byla objevena v roce 1965 Rosenbergem během jeho studií vlivu elektrického proudu na růst bakterií Escherichia Coli (Rosenberg, et al.). Principem její toxicity je vazba do molekuly DNA, čímž je znemožněna transkripce a replikace. Buňka se tak nemůže dále dělit, zastavuje proteosyntézu a následně směřuje k apoptóze. U nádorových buněk, které se dělí abnormálně rychle, je aplikace cisplatiny velmi účinná, avšak takovouto léčbou jsou zasaženy i okolní zdravé buňky. Cisplatina zůstává stále nejčastěji používaným cytostatickým léčivem, avšak následným vývojem byly objeveny další platnaté a platičité komplexy, které byly s většími či menšími úspěchy testovány při léčbě nádorových onemocnění (Wong, et al.). Karboplatina [cis-diamino(1,1cyklobutan-dikarboxyláto)platnatý komplex)] byla vyvinuta jako méně toxická alternativa k cisplatině vykazující méně vedlejších efektů (Go, et al.). Oxaliplatina [oxaláto-1,2-diaminocyklohexan platnatý komplex] byla později navržena jako další, již ‘třetí generace’ platinových léčiv (Raymond, et al., Arango, et al.). Spektrum aktivity, mechanismus působení a rezistence se u oxaliplatiny zdá být odlišný oproti ostatním platinovým léčivům a to včetně cisplatiny. Oxaliplatina je ojediněle neurotoxická kdežto u cisplatiny se projevují silné nefro a ototoxické účinky (Jerremalm, et al.).

Na rozdíl od snahy vyvíjení nových elektrochemických metod pro senzitivní stanovení aminokyselin existuje i směr vyvíjení metod za účelem studia tvorby komplexů peptidů s kovy. Pro studium peptidu Lys-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala jako fragmentu metalothioneinu v komplexu s kovy většina studií využívá metody jako DC voltametrii, diferenční pulsní polarografii (Mendieta, et al., Munoz, et al.), dále pak square wave voltametrii a cyklickou voltametrií (Nieto, et al., Harlyk, et al.). Pro studium interakce různých strukturních mutantů redox-aktivního proteinu kupredoxinu azurinu vážících ionty mědi byla využita cyklická voltametrie (Marshall, et al.). Pro studium interakce peptidu s kovy jsme se rozhodli využít metodu průtokové injekční analýzy s elektrochemickou detekcí (FIA-ED), kterou jsme již v minulosti použili k in vitro studiu interakce mezi tripeptidem glutationem a cisplatinou (Zitka, et al.). Průtokový systém oproti statické elektrochemii vyžaduje zvýšené požadavky na vlastnosti elektrody. Z toho vyplývá, že použití visící rtuťové kapkové elektrody, která má možnost obnovovat svůj povrch odkápnutím, je v průtokovém systému velmi problematické. Proto spojení elektrochemických technik s kapalinovou chromatografií využívá pevné substráty různých pracovních elektrod.

V této práci byla použita amperometrická detekce, kde jako detektor sloužila průtoková analytická cela s planární elektrodou ze skelného uhlíku, na které se při vhodném kladném aplikovaném potenciálu oxidují převážně redukované thiolové skupiny aminokyseliny cystein.

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Materiál a metody

Ke studiu komplexu pomocí metody průtokové injekční analýzy s elektrochemickou detekcí byl použit chromatografický systém (bez zapojené chromatografické kolony) s elektrochemickým detektorem. Systém se skládal z chromatografické pumpy s operačním rozsahem 0.001-9.999 ml.min-1 (Model 582 ESA, USA), autosampleru (Model 540, ESA, USA), který automaticky dávkoval vzorek o objemu 20 µl, dále byla před samotným detektorem nainstalována reakční smyčka o délce 1m. Detekce probíhala pomocí amperometrické cely (Model 5040, ESA, USA) obsahující planární pracovní elektrodu ze skelného uhlíku (GC). Elektroda byla mechanicky čištěna pomocí 0.1 µm aluminy (ESA, USA) a při laboratorní teplotě ultrazvukována při 40 W po dobu 5 minut ve vodní lázni Sonorex Digital 10 P Sonicator (Bandelin, Germany). Elektrochemická cela byla připojena ke kontrolnímu modulu Coulochem III (ESA, USA). Detekce probíhala při rozsahu aplikovaných potenciálu 0-1200mV. Analýza probíhala při laboratorní teplotě. Data byla zaznamenávána a vyhodnocena pomocí programu Clarity Verze 1.2.4 (Data Apex, Česká republika). Pro inkubaci vzorků před analýzou byl použit thermomixer (Eppendorf 5430, Německo).

Výsledky a diskuse

Pro studium interakcí mezi platinovými cytostatiky cisplatinou, karboplatinou, oxaliplatinou a vybranými peptidy kov-vazebné domény proteinu metalothioneinu byla použita technika kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí. Nejprve jsme vybrali dva z 23 fragmentů různých typů metalothioneinů (FMT). Byly vybrány fragmenty s označením FMT-11, který pochází z tura domácího (Bos Taurus) a FMT-13, který pochází z člověka (Homo sapiens). Dále jsme vybrali jeden C-terminální hexapeptid metalothioneinu se sekvencí KCTCCA, který byl označen jako FMT-0. Tento hexapeptid se vyskytuje n u myši domácí a byl již elektrochemicky studován, avšak metodou diferenční pulsní polarografie (Diaz-Cruz, et al.). Byla studována tvorba komplexů těchto tří fragmentů s cytotoxickými deriváty platiny cisplatinou (Cis-Pt), oxali platinou (Oxali-Pt) a karboplatinou (Carbo-Pt).



Obr. 1. Struktura studovaných nádorových cytostatik.

Abychom byli schopni posoudit rychlost a tedy účinnost tvorby komplexu, provedli jsme ze získaných hodnot pro každý ze vzorků výpočet rovnice regrese ve tvaru y=Ax+B, koeficient A udával míru interakce. Ze získaných výsledků je patrné, že interakce mezi fragmenty a každým derivátem platiny probíhaly různě. Zajímavý je trend intenzity interakce vzhledem k poměru reagentů. Oxaliplatina vykazuje nejvyšší tvorbu komplexu, pokud je přítomna ve směsi s fragmentem FMT-13 v poměru 1:1 a pro FMT-0 a FMT-11 v poměru 1:2. Oproti tomu při poměru 1:4 probíhala interakce pro všechny tři peptidy nejméně intenzivně. Podle získaných dat byla intenzita interakce peptidů s karboplatinou nejvíce podobná pro všechny tři poměry reagentů, avšak celkově nejvhodnější se zdál být poměr 1:2. Pro interakci fragmentů FMT-11 a FMT-13 s cisplatinou byl nejvýhodnější poměr reagentů 1:4 a pro FMT-0 poměr 1:2, který byl ale zároveň také nejhorším pro FMT-11. Zajímavé také bylo, že vůbec nejnižší intenzitu interakce jsme zaznamenali u FMT-13 a cisplatiny v poměru 1:1.

Závěr

Interakce volných aminokyselin, peptidů a proteinů s těžkými kovy nebo reaktivními sloučeninami obecně je problematikou, která má jen částečnou vědeckou sledovanost. V této práci jsme se věnovali studiu interakcí protinádorových léčiv na bázi cisplatiny s fragmenty kov vazné domény jednoho z nejdůležitějších kov-vázajících proteinu metalothioneinu.

Poděkování: Práce byla podporována grantovým výzkumnými projekty:
RECAMT GA AV IAA401990701, GA ČR 102/08/1546, IGA MZ 10200-3.

Literatura:

1. Rozencweig, M., et al., (1979): CISPLATIN – NEW ANTI-CANCER DRUG, Louvain Medical, 98: 679-684.
   
2. Raymond, E., et al., (2002): Cellular and molecular pharmacology of oxaliplatin, Mol. Cancer. Ther., 1: 227-235.
   
3. Fuertes, M. A., et al., (2003): Cisplatin biochemical mechanism of action: From cytotoxicity to induction of cell death through interconnections between apoptotic and necrotic pathways, Curr. Med. Chem., 10: 257-266.
   
4. Harper, B. W., et al., (2010): Advances in Platinum Chemotherapeutics, Chemistry-a European Journal, 16: 7064-7077.
   
5. Rosenberg, B., et al., (1965): Inhibition of cell division in Escherichia coli by electrolysis products from a platinum electrode, Nature, 205: 698-699.
   
6. Wong, E., et al., (1999): Current status of platinum-based antitumor drugs, Chem. Rev., 99: 2451-2466.
   
7. Go, R. S., et al., (1999): Review of the comparative pharmacology and clinical activity of cisplatin and carboplatin, J. Clin.
   Oncol., 17: 409-422.
   
8. Arango, D., et al., (2004): Molecular mechanisms of action and prediction of response to oxaliplatin in colorectal cancer cells, Brit. J. Cancer, 91: 1931-1946.
   
9. Jerremalm, E., et al., (2009): New Insights Into the Biotransformation and Pharmacokinetics of Oxaliplatin, Journal of Pharmaceutical Sciences, 98: 3879-3885.
   
10. Mendieta, J., et al., (1995): Electrochemical-Behavior of Metallothioneins and Related Molecules.1. Lys-Cys-Thr-Cys-CysAla Thionein Fragment [56-61] Mt-I, Electroanalysis, 7: 663-669.
    
11. Munoz, A., et al., (1995): Electrochemical-Behavior of Metallothioneins and Related Molecules. 3. Metallothionein, Electroanalysis, 7: 674-680.
    
12. Nieto, O., et al., (1996): Complexation properties of the metallothionein fragment Lys-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala [56-61] MT I with zinc using square wave voltammetry, Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 40: 215-222.
    
13. Harlyk, C., et al., (1997): Cyclic voltammetry study of the peptide Lys-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala [56-61] MT I in the presence of cadmium, Electroanalysis, 9: 608-613.
    
14. Marshall, N. M., et al., (2009): Rationally tuning the reduction potential of a single cupredoxin beyond the natural range, Nature, 462: 113-U127.
    
15. Zitka, O., et al., (2007): An investigation of glutathione-platinum(II) interactions by means of the flow injection analysis using glassy carbon electrode, Sensors, 7: 1256-1270.
    
16. Diaz-Cruz, M. S., et al., (1999): Zinc-binding properties of the C-terminal hexapeptide Lys-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala from mouse metallothionein: Analysis by differential pulse polarography and multivariate curve resolution, Analytica Chimica Acta, 385: 353-363.