Změny hladiny metalothioneinu u buněčných linií odvozených z karcinomu prostaty.

Klíčová slova: těžké kovy, thiolové sloučeniny, karcinom prostaty, nádorové markery, thioneiny

Úvod

Metalothioneiny (MT) patří do skupiny intracelulárních, nízkomolekulárních na cystein velmi bohatých proteinů o molekulové hmotnosti od 6-10 kDa (Obr. 1) (Hamer; Klaassen et al.). Díky své vysoké afinitě k těžkým kovům (Zn, Cd, As, atd.) je jejich hlavní funkcí homeostatická kontrola a detoxikace těchto těžkých kovů. Lidské MT patří do I. třídy metalothioneinu a jsou kódovány rodinou genů vytvářejících 10 isoforem. Vzniklé proteiny jsou rozděleny do čtyř skupin: MT-1, MT-2, MT-3 a MT-4. MT-1 protein existuje ve více isoformách, respektive MT-1 protein vytváří více subtypů kódovaných sadou MT-1 genů (MT-1A, MT-1B, MT-1E, MT-1F, MT-1G, MT-1X).

V organismu dospělých jedinců jsou nejvíce zastoupeny dvě isoformy MT (MT-1a, MT-2a), které se exprimují ve většině lidských tkání, v mozkové tkáni je přítomna pouze isoforma MT-3 (někdy označována jako růstový inhibiční faktor - GIF). MT-1 a MT-2 isoformy jsou obvykle exprimovány v lidském organismu ve velmi nízkých koncentracích. Jejich exprese výrazně stoupá při indukci mnoha exogenními a endogenními faktory jako jsou UV záření, těžké kovy, stresové hormony, volné kyslíkové radikály a cytokiny uvolňující se z poškozené tkáně či xenobiotika. Molekulární mechanismus exprese MT je prozatím znám velmi málo, ale pravděpodobně se ho účastní samotný kov vazbou na specifický transkripční faktor, protein označený jako metal transription factor 1 (MTF-1). Komplex kov-MTF-1 pak v jádře nasedá na metal-responsive element (MRE) v promotorové oblasti MT-genu a spouští jeho transkripci. Na syntéze MT se mohou podílet další regulační proteiny prostřednictvím responsivních elementů jako je glucocorticoid response element (GRE), interferon response element (IRE), signal transducers and activator protein (STAT) nebo antioxidant response element (ARE), dále vazebné receptory spojené s tvorbou druhých poslů či aktivací běžných transkripčních faktorů. Jednotlivé isoformy metalothioneinů se pak podílejí na metabolismu detoxikace a homeostázy těžkých kovů, účastní se ochrany organismu před vzniklými volnými kyslíkovými radikály a podporují regeneraci poškozené tkáně. MT je významný přenašeč iontů kovů v organismech. Nejčastěji váže Zn, ale velkou afinitu má i k Cu, čímž udržuje homeostatickou hladinu těchto kovů v organismu. Při výskytu toxických kovů v organismu je metalothionein schopen je navázat a přenést na místo detoxikace, s největší pravděpodobností do ledvin. Tímto mechanismem je tělo schopno se bránit proti iontům Cd, Hg, Pb a dalších těžkých kovů. MT má také významnou antioxidatiční roli. Spolu s GSH vytváří oxidačně redukční dvojici, která reguluje výskyt volných kyslíkových radikálů. Napomáhá tak chránit nukleové kyseliny před účinky ionizujícího záření, fosfolipidy membrán před oxidací a zajišťuje pro buňku redukční prostředí. V posledních letech je studována overexprese MT v souvislosti s nádorovými onemocněními (Eckschlager et al.; Krizkova et al.; Pedersen et al.). Tato overexprese je pozorována především u isoformy MT-1a a MT-2a ja převážně spojena s maligními nádory a je studována jako nový prognostický marker v progresi onemocnění, přežití pacientů, korelací s histologickým typem nádoru a nádorovým gradingem.

Experimentální část

Materiál a metody

V této studii byly použity čtyři prostatické buněčné linie: (a) PNT1A, buněčná linie odvozená z normálních lidských prostatických epiteliálních buněk (HPA Culture Collections, Salisbury, UK); (b) PC-3, buněčná linie odvozená ze 4. stupně adenokarcinomu prostaty (HPA Culture Collections, Salisbury, UK); (c) 22RVL, lidská nádorová epiteliální buněčná linie odvozená ze štěpu nádorové tkáně, propagována u kastrovaných myší (HPA Culture Collections, Salisbury, UK); (d) LNCaP, lidská nádorová epiteliální buněčná linie odvozená z metastatického místa v levé supraklavikulární lymfatické uzlině (ATCC, Manassas, VA, USA).

Lyzace buněk byla prováděna standardně pomocí RIPApufru s přídavkem inhibitoru proteáz, nebo mechanickou homogenizací a tepelnou denaturací.

Separace proteinů byla prováděna technikou SDS-PAGE na 12.5% gelech ve vertikálním uspořádání (BioRad, Hercules CA, USA). Po separaci byly proteiny přeneseny na nitrocelulózovou membránu western blottingem (BioRad, Hercules CA, USA). Následná imunodetekce probíhala s použitím monoklonální protilátky proti MT1a/2a (Abcam, Cambridge, UK) a v případě detekce PSAmonoklonální protilátkou anti-PSA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Imunohistochemická detekce MT byla prováděna pomocí R.T.U Vectastain universal ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).

Elektrochemické stanovení bylo prováděno na přístroji 747 VA Stand instrument ve spojení s 746 VA Trace Analyzer a 695 Autosampler (Metrohm, Switzerland) nebo na AUTOLAB Analyzer (EcoChemie, Netherlands) ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Switzerland) na visící rtuťové kapkové elektrodě.

Výsledky a diskuse

V této studii byly použity prostatické buněčné linie odvozené od karcinomu prostaty (LNCaP, PC-3, 22RVL) a dále prostatická buněčná linie odvozená z normálního epitelu (PNT1A - jedná se o imortalizovanou buněčnou linii prostatických epiteliálních buněk, získaných z prostaty 35 letého muže post mortem). Kultivace všech buněčných linií probíhala standardním způsobem v RPMI-1640 médiu s 10% FBS (LNCaP, 22RVL, PNT1A) nebo Ham´s F12 médiu se 7% FBS (PC-3) a 1x Strep/Pen při 37°C a 5% CO₂. Čas zdvojení (doubling time) je v rozmezí 30-40 hodin. Jakmile buňky dosáhly konfluence přibližně 80%, byly sklizeny a následně laboratorně zpracovány. Buněčné linie byly pravidelně kontrolovány, mikroskopickým počítáním buněk při rozsevu, dále vitalita buněk pomocí klasické trypan-blue metody a pak MTT test (životnost) při ovlivňování buněčných kultur zinečnatými ionty.

Pro separaci MT od ostatních proteinů byla použita standardní SDS-PAGE s 12.5% gely. Koncentrace 12.5% nebyla zvolena náhodně, ale byly zkoušeny různé koncentrace polyakrylamidu pro získání co nejlepší separace. Z literatury je známo, že MT tvoří nejen monomery (cca 6 kDa), ale i vícemery (12 - cca 40 kDa), což bylo z gelů patrné. Vzhledem k tomu, že separace jednotlivých forem MT je poněkud složitější, byla navržena technika imunoprecipitace pomocí magnetických částic a následného imunochemického stanovení MT, která je dále testována. Pro imunochemické stanovení bylo nutno nejprve zvolit vhodnou protilátku pro detekci MT1A/2A. Byly vyzkoušeny dvě protilátky - a) Mouse monoclonal [UC1MT] to metallothionein (Abcam, UK; ab12228), b) Rabbit polyclonal to metallothionein (Santa Cruz biotechnology, USA; sc-11377). Jako vhodnější a specifičtější se testováním ukázala protilátka firmy Abcam a s tou byly poté prováděny veškeré imunochemické experimenty. Kromě stanovení MT byl imunochemicky stanovován i prostatický specifický antigen (PSA), který je pro prostatickou tkáň specifický a také beta-aktin, jako vnitřní kontrola. Při těchto stanoveních jsme prokázali up-regulaci exprese PSA v prostatických nádorových buňkách (LNCaP, PC-3, 22RVL), naopak down-regulaci exprese MT.

Dále byla prováděna analýza MT in situ. Buňky byly napěstovány opět do konfluence cca 80%, následně byly zafixovány ledovou směsí MetOH/aceton 1:1 a dále zpracovány s barvícím ABC kitem a DAB+ jako substrátem pro detekci MT s použitím výše uvedené protilátky. Z výsledků (mikroskopické hodnocení buněk) je patrné, že exprese MT je v případě nádorových buněk extrémně snížena oproti buněčné linii PNT1A, která vychází z normální prostatické tkáně. Potvrdili jsme tak výsledky získané při testování jednotlivých primárních protilátek na buněčných lyzátech.

Elektrochemická detekce MT se provádí na plně automatickém analyzátoru Metrohm ve spojení s mikrodávkovačem vzorku v klasickém tříelektrodovém uspořádání pomocí tzv. Brdičkovy reakce. Právě Rudolf Brdička před více než 70 lety objevil katalytické vylučování vodíku ze základního elektrolytu v přítomnosti proteinů. Tato metoda byla později vylepšena a využita pro analýzu proteinů krevních sér pacientů s nádorovým onemocněním. Dlouho nebylo jasné, které proteiny se této reakce účastní, ale později bylo zjištěno, že jsou to právě látky obsahující -SH skupiny, mezi které patří i MT (Adam et al.; Fabrik et al.; Kizek et al.).

Měření probíhá tak, že na pracovní elektrodu, kterou je visící rtuťová elektroda dochází k akumulaci vzorku a stanovení probíhá v základním elektrolytu, obsahujícím kobaltitou sůl v amonném pufru s pH 9.6.

Nejprve bylo potřeba najít vhodné prostředí pro elektrochemickou analýzu. Ukázalo se, že prostředí lyzačního RlPApufru není příliš vhodné z důvodu přítomnosti povrchově aktivních látek, které ovlivňují elektrochemickou detekci. Buněčnou suspenzi jsme proto jen mechanicky dezintegrovali homogenizátorem a tepelně denaturovali. Tak jak bylo řečeno výše, MT je termostabilní protein a tepelnou denaturací se odstraní případné interferující biomakromolekuly. Takový postup se nám osvědčil, proto jsme dále pro elektrochemické stanovení postupovali tímto způsobem. Provedli jsme několik experimentů a z měření vyplývá, že exprese MT je u nádorových linií snížena oproti kontrolní buněčné linii. Na obr. 2 je ukázán jeden z výsledků - elektrochemické stanovení MT pomocí Brdičkovy reakce a v grafu přepočet množství MT, vyjádřená v jednotkách µg MT/g proteinu.

Závěr

Tato studie přináší nové důležité informace o expresi MT na proteinové úrovni v prostatických nádorových buňkách. Z výsledků imunohistochemických a elektrochemických analýz vyplývá, že exprese MT je v nádorových prostatických buňkách down regulována oproti normální prostatické buněčné linii. Tento efekt přisuzujeme rapidně snížené koncentraci zinečnatých iontů, která je za normální situace v prostatě relativně vysoká. Přesné vysvětlení tohoto jevu doposud není známo (Costello et al.). Proto se v další experimentální práci chceme zaměřit nejen na MT ale také na zinkové transportéry, které v tomto procesu hrají důležitou roli.

PoděkováníPříspěvek vznikl za podpory GAČR 301/09/P436, IGA MZ10200-3/2009, GAAVIAA401990701

Literatura

1. Adam, V., et al., (2008): Application of the Brdicka reaction in determination of metallothionein in patients with tumours. Chemicke Listy, 102: 51-58.
2. Costello, L. C., et al., (2004): Role of zinc in the pathogenesis and treatment of prostate cancer: critical issues to resolve. Prostate Cancer and Prostatic Diseases, 7: 111-117.
3. Eckschlager, T., et al., (2009): Metallothioneins and Cancer. Current Protein & Peptide Science, 10: 360-375.
4. Fabrik, I., et al., (2008): Employment of Electrochemical Techniques for Metallothionein Determination in Tumor Cell Lines and Patients with a Tumor Disease. Electroanalysis, 20: 1521-1532.
5. Hamer, D. H., (1986): METALLOTHIONEIN. Annual Review of Biochemistry, 55: 913-951.
6. Kizek, R., et al., (2001): Determination of metallothionein at the femtomole level by constant current stripping chronopoten-tiometry. Analytical Chemistry, 73: 4801-4807.
7. Klaassen, C. D., et al., (1999): Metallothionein: An intracellular protein to protect against cadmium toxicity. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 39: 267-294.
8. Krizkova, S., et al., (2009): Using of chicken antibodies for metallothionein detection in human blood serum and cadmium-treated tumour cell lines after dot- and electroblotting Electrophoresis, 30: 3726-3735.
9. Pedersen, M. O., et al., (2009): The role of metallothionein in oncogenesis and cancer prognosis. Progress in Histochemistry and Cytochemistry, 44: 29-64.